黃斑藍子魚皮膚黏液對刺激隱核蟲及一些病原菌的抑殺作用

黎睿君 劉 芳 王方華, 李安興

(1. 中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室, 水產品安全教育部重點實驗室, 廣州 510275;2. 華南理工大學輕工與食品學院, 廣州 510640)

黃斑藍子魚(Siganus oramin)屬于鱸形目(pereiformes)、藍子魚科(Siganidae), 是近海暖水性小型魚類。它適宜生長的水溫和鹽度范圍較廣, 是南海區域普遍養殖的魚類之一。前期研究發現, 黃斑藍子魚對刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)感染具有明顯抵抗力, 其血清中存在一種新奇的抗寄生蟲蛋白(APP), 該蛋白對刺激隱核蟲幼蟲和滋養體具有強烈的殺滅作用[1]。魚類的黏膜是抵御寄生蟲感染的第一道重要屏障, 已知魚類的黏液中含有諸多抑殺病原的活性物質[2,3], 且魚類表皮黏液的免疫學功能證實[4,5]。黃斑藍子魚體表黏液是否對刺激隱核蟲同樣具有殺滅活性是本研究的出發點。前期研究發現APP在體外對多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)和布氏錐蟲(Trypanosoma brucei brucei)同樣具有較強的殺滅作用, 對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)等 3種革蘭氏陽性菌以及大腸桿菌(Escherichia coli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和美人魚發光桿菌殺魚亞種(Photobacterium damselae subsp.)等6種革蘭氏陰性菌均有抑菌效果, 但對于黑曲霉(Aspergillus niger)和小麥赤霉菌(Gibberella saubinetii)兩種真菌則無抑菌作用[6]。因此, 在研究黃斑藍子魚皮膚黏液是否對刺激隱核蟲同樣具有殺滅活性的同時, 開展了黏液對上述病原殺滅活性的驗證, 同時選取了南海區較為常見的四種海水經濟魚類, 即斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)、美國紅魚(Sciaemops ocellatus)、花尾胡椒鯛(Plectorhinchus cinctus)、 卵形 鯧 鲹(Trachinotus ovatus)的皮膚黏液作為對照。探究黃斑藍子魚皮膚黏液抗刺激隱核蟲活性, 以及研究該黏液對APP相關抑殺病原的作用, 為進一步研究黃斑藍子魚對刺激隱核蟲的天然抗性提供了基礎, 為深入開展 APP蛋白的研究提供了新的路徑。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

1.2 實驗蟲株

刺激隱核蟲(C. irritans)GD1株由本實驗室保存,多子小瓜蟲(I. multifiliis)由中國水產科學院珠江水產研究所趙飛博士提供, 布氏錐蟲(T. brucei brucei)由中山大學華南寄生生物研究中心倫照榮教授提供。

1.3 實驗菌株

金黃色葡萄球菌(S. aureus)ATCC25923 株、大腸桿菌(E. coli)、溫和氣單胞菌(A. sobria)、霍亂弧菌(V. cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、海豚鏈球菌(S.iniae)、星形諾卡氏菌(Nocadia asteroides)、美人魚發光桿菌殺魚亞種(P. damselae subsp.)、小麥赤霉菌(G. saubinetii)、黑曲霉菌(A. niger)均為本實驗室保存。

1.4 黏液樣品的制備

用玻片輕輕刮取實驗魚背部黏液, 溶于 PBS(pH 7.4), 4000 r/min, 4℃離心20min, 取上清液, 冷凍干燥后?20℃保存。實驗時, 取凍干的樣品重溶于PBS, BCA法測定黏液樣品蛋白濃度。

1.5 對刺激隱核蟲、多子小瓜蟲和布氏錐蟲的殺滅作用試驗

參照但學明等阻動實驗方法[7], 在96孔培養板中, 每孔分別加入100 μL含有刺激隱核蟲幼蟲(200個/100 μL)或刺激隱核蟲滋養體(200 個/100 μL)的蟲液, 同時向每孔中加入 20 μL(5.0 mg/mL)黃斑藍子魚黏液, 輕輕混勻, 1h后統計各孔中寄生蟲的死亡率, 以顯微鏡下觀察蟲體纖毛或鞭毛不擺動為死亡判定依據。同時從各孔取少量處理后的蟲液于載玻片上, 用于顯微鏡觀察。以斜帶石斑魚、美國紅魚、卵形鯧 鲹和花尾胡椒鯛的黏液作為對比組, 滅菌海水作為空白對照組。黏液對多子小瓜蟲幼蟲及布氏錐蟲的處理方法同上。

1.6 黃斑藍子魚黏液最低殺蟲濃度的測定

將黃斑藍子魚皮膚黏液用 PBS(pH 7.4)稀釋到5.0、4.0、3.0、2.0、1.0和0.5 mg/mL, 其余處理方法同上, PBS作為空白對照, 1h 后統計各寄生蟲死亡率。

1.7 對細菌的抑制作用試驗

抑菌活性試驗 參照Nagashima, et al.[8]方法,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在 37℃下培養, 溫和氣單胞菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、海豚鏈球菌、星形諾卡氏菌、美人魚發光桿菌殺魚亞種在28℃下培養, 18—48h后觀察抑菌圈的大小, 試驗所用皮膚黏液均用PBS(pH 7.4)稀釋到5.0 mg/mL。

最小抑菌濃度的測定 將處于對數生長期的金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、海豚鏈球菌、溶藻弧菌、溫和氣單胞菌和副溶血弧菌分別稀釋至 105CFU/mL, 向96孔板中加入50 μL菌液。將黃斑藍子魚黏液用 PBS(pH 7.4)稀釋至 5.0、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16、0.08、0.04 mg/mL, 每孔加入 100 μL 黏液溶液, 放置各細菌于對應培養溫度的生化培養箱靜置培養, 24h時測其A600值, 具有顯著性抑菌效果的最低黏液蛋白濃度為其最小抑菌濃度。

1.8 對真菌抑制作用試驗

接種小麥赤霉菌和黑曲霉菌于斜面 PDA固體培養基, 30℃培養 48h, 去離子水沖洗, 收集孢子,將孢子濃度稀釋至104CFU/mL, 與等體積5 mg/mL的黃斑藍子魚皮膚黏液混合, 30℃靜置培養 3h, 涂板計數, 觀察其生長情況。

1.9 數據處理

實驗中的數據用 SPSS 16.0中 One-wayAnova法進行平均值方差計算和顯著性差異分析(DUNCAN法), P值顯著性差異臨界水平為0.05。

2 結果

2.1 皮膚黏液對寄生蟲的殺滅作用

黃斑藍子魚(S. oramin)皮膚黏液對刺激隱核蟲幼蟲的致死率與其他4種實驗魚黏液相比存在顯著性差異(圖1)。共孵育60min后, 黃斑藍子魚皮膚黏液對刺激隱核蟲幼蟲的致死率為 100%, 而花尾胡椒鯛、美國紅魚、斜帶石斑魚和卵形鯧等4種魚的黏液對刺激隱核蟲幼蟲的致死率分別為(26.67±2.92)% 、 (25.00±3.27)% 、 (31.67±5.8)% 、(18.33±3.27)%, 均不及 50%, 其中卵形鯧 鲹黏液的作用效果與空白對照組相近。

在光學顯微鏡下觀察, 黃斑藍子魚黏液作用于刺激隱核蟲幼蟲5min后, 大部分幼蟲出現停止運動,形態由橢圓形變為圓形(圖2B和D), 纖毛從蟲體表面脫落(圖 2E), 蟲體表層逐漸破裂, 并有大量內含物釋放(圖2C、F和G), 其他4種實驗魚皮膚黏液與刺激隱核蟲作用后, 大部分幼蟲活動正常, 死亡的幼蟲沒有發生蟲體形態變化(圖 2H), 空白對照組除少量自然死亡, 其他活動正常。

黃斑藍子魚黏液與刺激隱核蟲滋養體共孵育5min后, 滋養體外膜出現分離(圖 3B), 細胞壁有孔洞形成, 并伴隨內含物釋放(圖3C和D), 30min后,整個滋養體被破壞(圖3E)。其他4種實驗魚皮膚黏液與滋養體作用后, 滋養體形態無明顯變化(圖3F)。

圖1 經5種實驗魚皮膚黏液作用60min后的刺激隱核蟲幼蟲死亡率Fig. 1 Theronts mortality of C. irritans incubated with the skin mucus of five species fish for 60min

圖2 光學顯微鏡下黃斑藍子魚皮膚黏液對刺激隱核蟲幼蟲的作用觀察Fig. 2 Light microscopy analysis of the effect of rabbitfish skin mucus on C. irritans

圖3 光學顯微鏡下黃斑藍子魚皮膚黏液對刺激隱核蟲滋養體的作用觀察Fig. 3 Light microscopy analysis of the effect of S. oramin skin mucus on C. irritans trophonts

黃斑藍子魚皮膚黏液與多子小瓜蟲共孵育60min后, 多子小瓜蟲的死亡率達100%, 而花尾胡椒鯛、美國紅魚、斜帶石斑魚和卵形鯧 鲹皮膚黏液對多子小瓜蟲幼蟲的致死率分別達到(23.33±2.92)%、(30.50±3.27)%、(50.25±5.84)%和(26.67±3.27)%(圖4)。黃斑藍子魚黏液作用于多子小瓜蟲5min后, 光學顯微鏡下觀察發現, 大部分幼蟲蟲體形態由橢圓形變圓形(圖 5B), 蟲體纖毛脫落, 表層破裂, 伴隨內含物泄漏(圖5 C、D和E), 其他四種魚皮膚黏液作用多子小瓜蟲后, 大部分幼蟲沒有死亡, 死亡的幼蟲沒有發生蟲體形態變化。

黃斑藍子魚皮膚黏液與布氏錐蟲共孵育 60min后, 布氏錐蟲的死亡率達100%, 花尾胡椒鯛、美國紅魚、斜帶石斑魚和卵形鯧 鲹皮膚黏液對布氏錐蟲的致死率分別達到(32.33±3.31)%、 (23.15±2.83)%、(18.50±2.66)%和(19.67±3.59)%(圖 6)。倒置顯微鏡觀察發現, 死亡的錐蟲停止運動, 蟲體變形破裂。

圖4 經5種實驗魚皮膚黏液作用60min后的多子小瓜蟲幼蟲死亡率Fig. 4 Theronts mortality of I. multifiliis incubated with the skin mucus of five species of fish for 60min

圖5 光學顯微鏡下觀察黃斑藍子魚皮膚黏液對多子小瓜蟲的作用Fig. 5 Light microscopy analysis of the effect of S. oramin mucus on I. multifiliis

圖6 經5種實驗魚皮膚黏液作用60 min后的布氏錐蟲死亡率Fig. 6 Theronts mortality of T. brucei brucei incubated with the skin mucus of five species fish for 60 min

黃斑藍子魚皮膚黏液蛋白對3種寄生蟲的最低殺蟲濃度(Minimum Parasiticidal Concentration, MPC)測定結果顯示, 其對刺激隱核蟲、多子小瓜蟲和布氏錐蟲的MPC分別為4.0、5.0和3.0 mg/mL。蛋白濃度為5.0 mg/mL的黏液在作用5min后, 對刺激隱核蟲幼蟲致死率達100%; 4.0 mg/mL蛋白濃度的黏液作用 5min后, 刺激隱核蟲的死亡率達到(61.67±5.84)%, 60min后其死亡率接近100%; 3.0 mg/mL蛋白濃度的黏液作用 30min后, 刺激隱核蟲死亡率達到(43.33±5.84)%(圖7)。對于4.0 mg/mL和3.0 mg/mL蛋白濃度的黏液在作用5min后, 多子小瓜蟲的死亡率分別可達(64.00±2.92)%和(45.67±5.84)%, 在30min后死亡率分別上升到(84.33±5.84)%和(68.67±2.92)%(圖8)。同樣為4.0 mg/mL和3.0 mg/mL蛋白濃度的黏液在作用5min后, 對布氏錐蟲的致死率分別為(86.86±2.26)%和(76.29±5.08)%, 60min 后致死率達 100%(圖 9)。

圖7 不同濃度黃斑藍子魚皮膚黏液對刺激隱核蟲幼蟲的作用Fig. 7 Effect of different concentrations of S. oramin skin mucus on C. irritans theronts

2.2 黏液對病原菌的抑制作用

圖8 不同濃度黃斑藍子魚皮膚黏液對多子小瓜蟲幼蟲的作用Fig. 8 Effect of different concentrations of S. oramin skin mucus on I. multifiliis theronts

圖9 不同濃度黃斑藍子魚皮膚黏液對布氏錐蟲的作用Fig. 9 Effect of different concentrations of S. oramin skin mucus on T. brucei brucei theronts

黏液抑菌實驗結果顯示, 黃斑藍子魚皮膚黏液除了對大腸桿菌沒有抑菌活性外, 對其他 8種實驗細菌皆有明顯的抑菌活性, 對金黃色葡萄球菌ATCC25923 株、霍亂弧菌和星形諾卡氏菌的抑菌活性較強; 斜帶石斑魚皮膚黏液對所有實驗細菌都有明顯的抑菌圈, 其中對霍亂弧菌抑菌活性較強(表1、圖 10)。 卵形鯧、花尾胡椒鯛和美國紅魚皮膚黏液在實驗中沒有表現出抑菌活性。

在最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)測定中, 黃斑藍子魚皮膚黏液對金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、海豚鏈球菌、溶藻弧菌、溫和氣單胞菌和副溶血弧菌的 MIC分別為0.16、0.16、0.08、0.63、0.63和 0.63 mg/mL。

在黏液對真菌的抑菌實驗中, 5種實驗魚皮膚黏液對小麥赤霉菌和黑曲霉菌沒有明顯的抑菌活性,與空白對照相比, 無顯著性差異。

3 討論

本實驗研究結果表明, 相對于其他實驗用魚,黃斑藍子魚黏液, 表現出顯著的殺滅刺激隱核蟲活性。在魚類寄生蟲侵染宿主過程中, 寄生蟲首先附著在皮膚或鰓等部位, 因此宿主在抵御寄生蟲過程中, 黏液是第一道屏障, 在之前的研究中發現, 黃斑藍子魚較其他實驗中的 7種魚, 對刺激隱核蟲的感染強度最低[1]。黃斑藍子魚黏液抗刺激隱核蟲活性在一定程度解釋了該魚對刺激隱核蟲的不敏感性。

黃斑藍子魚皮膚黏液存在一種新的殺寄生蟲機制。在以往的殺蟲物質研究中, piscidin2可以殺滅多子小瓜蟲和刺激隱核蟲, 它會引起刺激隱核蟲幼蟲腫脹和空泡化, 但沒有引起蟲體破裂, 對淡水小瓜蟲的滋養體和包囊沒有作用[9]; 抗刺激隱核蟲抗體可以使幼蟲死亡, 幼蟲運動減慢聚集成團, 同時幼蟲會分泌一些黏性物質, 使纖毛纏繞在一起[7]。在本研究中, 刺激隱核蟲和多子小瓜蟲的幼蟲在經過黃斑藍子魚皮膚黏液作用后, 均出現纖毛脫落、蟲體腫脹、外膜破裂和內容物泄漏等現象, 因此推測黃斑藍子魚皮膚黏液存在一種新的殺蟲機制。

表1 黃斑藍子魚和斜帶石斑魚皮膚黏液對9種細菌抑菌效果Tab. 1 Antibacterial activity of skin mucus from S. oramin and E. coioides

圖10 五種實驗魚黏液對9種細菌的抗菌活性Fig. 10 Antibacterial activity of mucus of five species of fish

關于黏液抗菌實驗結果, 黃斑藍子魚皮膚黏液除了對大腸桿菌沒有抑菌活性之外, 對其他 8種實驗細菌皆表現出明顯的抑菌活性, 說明黃斑藍子魚皮膚黏液具有廣泛的抑菌譜。點藍子魚(Siganus guttatus)和褐藍子魚(Siganus fuscescens)的黏液對嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、美人魚發光桿菌殺魚亞種、鼠傷寒沙門氏菌、腐敗希瓦菌, 鰻弧菌和副溶血性弧菌具有抑菌活性[8], 該報道與本研究結果相似。在黏液抗真菌實驗中, 黃斑藍子魚皮膚黏液對實驗采用的2種真菌孢子沒有明顯的抗性。真菌孢子的細胞壁較厚, 對環境的耐受力強, 抗菌活性物質很難對真菌孢子造成破壞, 至于黃斑藍子魚皮膚黏液對其他真菌是否有抗菌活性有待研究。再有, 不同的黏液粗提溶劑對黏液的抗菌活性可能會產生影響。分別用純水、乙醇和二氯甲烷對13種魚類的黏液進行粗提, 發現這三種溶劑所提取的抗菌活性物質的抗菌效果表現出明顯差異[10]。

黃斑藍子魚皮膚黏液抗寄生蟲和抗菌活性物質可能為同一物質。Wang, et al.發現純化的APP不僅對刺激隱核蟲具有殺滅活性, 同時對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有殺滅活性[1,6]。據此推測, 黃斑藍子魚皮膚黏液中的抗寄生蟲因子可能同樣具有抗菌活性。迄今為止, 所發現的抗菌活性物質同時對寄生蟲具有抗性的種類較少。目前發現了一些抗菌肽對利什曼原蟲、瘧原蟲以及阿米蟲等具有抗性[11—13]。而在魚類中, 從虹鱒分離到的類組蛋白(Histone-like protein, HLP)對卵圓鞭毛蟲有致死作用[14], 從雜交條紋鱸分離到的piscidin2對刺激隱核蟲、車輪蟲和卵圓鞭毛蟲有致死作用, 斑點叉尾中類似 Hbβ蛋白可以殺死多子小瓜蟲[15], 這些蛋白只具有抗寄生蟲活性。若黃斑藍子魚皮膚黏液中的抗寄生蟲因子兼具抗菌活性, 其殺微生物機制值得進一步研究。

在本研究中, 黃斑藍子魚黏液無論是對海水魚類寄生蟲、淡水魚類寄生蟲和哺乳動物寄生蟲均表現出明顯的抗蟲效果, 說明它沒有抗寄生蟲特異性,它是否對其他的寄生蟲還有明顯的作用需要進一步的實驗證明。