基于線粒體Cytb基因全序列的松江鱸群體遺傳結構分析

高天翔畢瀟瀟趙林林李創舉

(1.中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003; 2.中國水產科學院長江水產研究所, 荊州 434000)

基于線粒體Cytb基因全序列的松江鱸群體遺傳結構分析

高天翔1畢瀟瀟1趙林林1李創舉2

(1.中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003; 2.中國水產科學院長江水產研究所, 荊州 434000)

對松江鱸(Trachidermus fasciatusHeckel)中國沿海7個群體和日本有明海群體的線粒體Cytb基因全序列進行了測定、分析。結果顯示: 47個個體共檢測到31個單倍型, 8個群體均呈現出較高的單倍型多樣性(0.60—1.00)和較低的核苷酸多樣性(0.0005—0.0041)的特點。AMOVA分析結果及單倍型鄰接關系樹和單倍型網絡關系圖均顯示松江鱸分為中國和日本兩個世系, 而中國世系的7個群體未呈現出明顯的地理遺傳結構。基于核苷酸Kimura雙參數替代模型計算得出的中國和日本兩個世系的凈遺傳距離, 再參照其他硬骨魚類線粒體Cytb基因2%/Ma(百萬年)的分歧速率, 推測松江鱸中日兩個世系間分化時間約為41萬年前。對中國世系進行群體歷史動態分析, 中性檢驗結果均為負值且顯著, 核苷酸不配對分布呈單峰型, 表明松江鱸中國世系曾發生過群體擴張, 其擴張時間大約為12萬年前。

松江鱸;Cytb基因; 全序列; 遺傳結構; 群體擴張

松江鱸(Trachidermus fasciatus Heckel)隸屬于鲉形目(Scorpaeniformes)、杜父魚科(Cottidae)、松江鱸屬(Trachidermus), 俗稱四鰓鱸、花鼓魚、媳婦魚等。松江鱸是一年生肉食性降河洄游魚類, 其營養價值和藥用價值高[1], 與黃河鯉魚、松花江鮭魚、黑龍江興凱湖鲌并列為“中國四大淡水名魚”。松江鱸為西北太平洋所特有, 僅分布于中國、朝鮮半島和日本南部, 我國分布于黃渤海和東海沿岸以及沿岸諸河下游及河口[2,3]。近年來, 由于工業有害污水及農藥化肥等對江河口和沿海的嚴重污染, 松江鱸數量急劇下降; 與此同時, 攔河建壩、水閘等水利設施的大量興建, 截斷了松江鱸的洄游通道, 導致其數量急劇下降, 進入內陸水域的松江鱸魚苗數量大為減少, 嚴重影響了其資源的恢復, 在一些原有分布記錄的水域已難覓其蹤跡。松江鱸現為我國野生動物重點保護二級水生動物[4], 2004年被列入中國物種紅色名錄。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)結構簡單, 呈母性遺傳, 進化速度快且不發生重組, 是一種應用較廣的分子標記, 其中一些基因已被廣泛用于魚類群體遺傳學和系統發育關系研究[5—7]。細胞色素b (Cytochrome b, Cytb)基因進化速度適中, 不僅容易使用通用引物擴增和測序, 而且它還是mtDNA上唯一的結構和功能被了解的較為清楚的蛋白編碼基因[8,9]。Cytb被認為是了解種質資源狀況和群體遺傳結構的理想工具, 近年來已成為魚類遺傳多樣性研究中常用的標記之一[7]。

目前對松江鱸魚的報道多集中在資源調查與保護、繁育及生理生態等方面[3,10—12], 關于遺傳多樣性的研究相對較少。王金秋等[13]、徐建榮等[14,15]、劉海林等[16]分別用同工酶、AFLP、SSR和線粒體控制區標記對我國黃渤海松江鱸群體的遺傳多樣性進行了初步研究, 但樣品分布點均較少。本研究基于線粒體Cytb基因全序列分析了日本有明海和中國渤海、黃海及東海近海松江鱸群體的遺傳結構, 旨在為松江鱸種質資源的保護和管理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

松江鱸樣品于2007至2010年采自于日本有明海(Ariake Sea)、大連(DL)、丹東(DD)、秦皇島(QHD)、東營(DY)、榮成(RC)、文登(WD)、杭州灣(HZB)8個地點(圖1)。除日本有明海松江鱸樣本數為12尾 外, 其他群體均為5尾,共計47尾。樣品經形態學鑒定后,均用95%乙醇固定, 于?20℃冰箱中保存。

圖1 松江鱸采樣地點Fig.1 Sampling sites of T.fasciatus

1.2 實驗方法

基因組DNA的提取 取松江鱸肌肉組織約100 mg, 采用標準的酚-氯仿方法提取基因組DNA,將乙醇沉淀后的基因組DNA于100 μL超純水溶解, 4℃保存備用。

目的片段的PCR擴增 根據GenBank中報道的相近種Cytb全序列及現有的通用引物[17], 共采用了3對引物對松江鱸線粒體Cytb基因全序列進行擴增, 引物分別為:

PCR 反應體系總體積為50μL, 其中: 10×PCR緩沖液(200 mmol/L Tris-HCl, pH 8.4; 200 mmol/L KCl; 100 mmol/L (NH4)2SO4; 15 mmol/L MgCl2) 5 μL, dNTP 200 μmol/L, 引物各0.2 μmol/L, Taq酶1.25 U (大連寶生物公司), 模板DNA 20 ng, 加水至50 μL。應用Eppendorf熱循環儀進行PCR反應, 反應條件如下: 首先94℃預變性5min, 之后進行35個循環,每個循環包括94℃變性45s、50℃退火45s、72℃延伸45s, 最后72℃延伸10 min。以上反應均設陰性對照以排除DNA污染的情況。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物, 凝膠成像系統拍照。

純化回收及測序 PCR產物經1%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測, 產物電泳后于紫外燈下切割目的條帶, 用DNA膠回收試劑盒進行產物的純化回收。純化產物送上海桑尼生物有限公司進行雙向測序,測序反應采用與PCR反應一致的引物。

1.3 數據分析

序列分析 所有序列均由Dnastar軟件包進行編輯、校對和排序, 并對排序結果進行分析和手工校正。利用Arlequin3.1[18]軟件計算堿基組成、變異位點數、單倍型數、平均核苷酸差異數、單倍型多樣性和核苷酸多樣性。

群體結構分析 應用Modeltest3.7[19]對線粒體Cytb基因全序列進行最佳替換模型篩選, 并估計相關參數。根據篩選的模型和相關參數, 利用Paup4.0[20]構建單倍型鄰接關系樹來探討單倍型的遺傳結構。利用Mega4.0[22]軟件基于Kimura雙參數模型計算中國世系和日本世系之間的凈遺傳距離以估算中日松江鱸的分化時間。使用分子變異分析(AMOVA)來評估群體間遺傳變異, 通過1000次重抽樣來檢驗不同遺傳結構水平上協方差的顯著性。采用分化固定指數(Fst)來評價兩兩群體間的遺傳差異, 通過1000次重抽樣來檢驗兩兩群體間Fst的顯著性。通過設定兩種AMOVA分析來檢驗松江鱸的群體遺傳結構: 一是將8個群體都劃分為一個組群以驗證群體間是否具有顯著的遺傳分化; 二是按樣品的地理來源將松江鱸8個群體劃分為2個組群,分別對應不同的海區以驗證是否存在顯著的地理結構, 日本有明海群體劃分為日本組群, 其余7個群體劃分為中國組群。

群體歷史動態分析 在Arlequin3.1[18]軟件中, 采用中性檢驗和核苷酸不配對分布兩種方法來檢測松江鱸的群體歷史動態。首先由Tajima’s D[23]檢驗和Fu’s Fs[24]檢驗來進行中性檢驗, 其次進行核苷酸不配對分布檢測。采用最小方差法來檢驗核苷酸不配對的觀測值和群體擴張模型下的預期分布之間是否一致, 采用廣義非線性最小方差法來估算擴張參數τ。根據公式τ= 2ut計算實際的擴張時間, 其中u為所研究的整個序列長度的突變速率, t是自群體擴張開始到現在的時間。參照其他硬骨魚類的線粒體Cytb基因2%/Ma(百萬年)的分歧速率[25,26]來估算松江鱸群體擴張時間。

2 結果

2.1 序列變異及遺傳多樣性

所分析的8個群體、47尾松江鱸個體的線粒體Cytb基因全序列的長度均為1141 bp, 其中C、T、A和G含量分別為30.0%、28.2%、23.0%和16.8%, A+T的含量(51.2%)略高于C+T的含量(48.8%), Cytb基因組成具有較大的偏向性, G的含量較低。在所有47個個體的1141 bp的序列中, 共檢測到38個變異位點, 約占總序列長度的3.33%, 簡約信息位點30個, 單一變異位點8個。這些變異位點共定義39個核苷酸替代(37個轉換和2個顛換), 未發現插入、缺失現象(圖2)。47個個體中共檢測到31單倍型, 所有單倍型已經提交到GenBank, 登錄號為JX079997-JX080027。在所有單倍型中, 2個單倍型為共享單倍型, 其他29個單倍型均為群體特有單倍型; 共享單倍型中, Hap1為東營、大連和杭州灣三個群體共享, Hap16為文登和丹東兩個群體共享。

單倍型多樣性指數整體較高, 而核苷酸多樣性指數相對較低(表1)。其中, HZW、WD、QHD和DD群體的單倍型多樣性指數最高, 均為1.00, RC和DY群體最低, 均為0.6; WD群體的核苷酸多樣性指最高, 為0.0041, DY群體最低, 為0.0005。所有樣本作為一個群體進行數據分析, 單倍型多樣性指數0.97, 核苷酸多樣性指數為0.0059。

2.2 群體遺傳結構

從松江鱸8個地理群體的遺傳距離(表2)來看,群體內的遺傳距離為0.0005—0.0041, 中國組群各群體間遺傳距離為0.0014—0.0058, 日本群體和中國各群體間的遺傳距離0.0095—0.0120(表2)。此結果表明, 松江鱸日本群體和中國各群體間的遺傳距離明顯大于中國各群體間的遺傳距離, 中國各群體間的遺傳距離與群體內的遺傳距離處于同一水平,無明顯遺傳分化。兩兩群體之間的Fst值(表2)顯示,日本群體和中國各群體之間的Fst值為0.8008—0.8922, 統計檢驗均顯著(P<0.05); 而中國各群體之間的Fst值為0.0736—0.3984, 統計檢驗均不顯著(P>0.05); 中國組群和日本組群之間的Fst值為0.7499, 統計檢驗顯著(P<0.05)。AMOVA 分析結果顯示松江鱸中國組群和日本組群之間已經產生一定程度的遺傳分化, 而中國各群體內不存在顯著的遺傳結構。基于Kimura雙參數模型計算得到的松江鱸中國組群和日本組群間凈遺傳距離為0.082, 以線粒體Cytb基因序列2%/百萬年的核苷酸分化速率計算[25,26], 中國組群和日本組群的分化年代大約在41萬年前。

圖2 松江鱸線粒體Cytb 基因序列變異位點Fig.2 Variable sites of mitochondrial Cytb gene in T.fasciatus

以圖們江杜父魚(Cottus hangiongensis)和賴氏杜父魚(Cottus reinii)(GenBank登錄號分別為NC_014851、NC_004404)為外群, 基于最適模型進行1000次自展檢驗, 利用PAUP4.0構建鄰接系統樹(圖3)。結果顯示松江鱸群體明顯分為中國和日本兩個世系, 而中國各群體之間沒有明顯的地理遺傳結構。基于簡化的中介網絡法構建的松江鱸單倍型網絡關系圖(圖4)亦明顯分為中國和日本兩個世系, 其中中國世系內單倍型Hap1位于網絡圖中心, 其他單倍型均經過一步或幾步突變連接到Hap1, 由此推測Hap1為中國群體的原始單倍型。

表1 松江鱸各群體的樣品信息和遺傳多樣性參數Tab.1 Sample information and genetic diversity parameters in different populations of T.fasciatus

表2 松江鱸群體內遺傳距離(對角線)及兩兩群體間遺傳距離(上對角線)和遺傳分化系數(Fst)(下對角線)Tab.2 Pairwise genetic distances within (diagonal) population, and genetic distance (below diagonal), fixation index (Fst) (above diagonal) between populations of T.fasciatus

2.3 群體歷史動態

松江鱸中國世系內不存在明顯的遺傳分化, 將其看作一個群體進行歷史動態分析; 中性檢驗表明(表2), Tajima’s D 和Fu’s Fs值均為負值, 并且統計檢驗均達顯著水平(P<0.05), 單倍型核苷酸不配對分布成單峰形, 與群體擴張下的預期相符合(圖5),提示松江鱸經歷了群體歷史擴張事件。采用最小方差法對核苷酸不配對的觀測值和群體擴張模型下的預期值之間的一致性進行擬合優度檢驗, 結果顯示SSD值和Raggedness指數均較小, 統計檢驗均不顯著(P>0.05)(表3), 表明所觀測的核苷酸不配對分布沒有顯著偏離群體擴張模型。采用廣義非線性最小方差法估算松江鱸中國世系擴張參數τ值為2.793 (95% CI: 1.947—5.178), 據此推算松江鱸的群體擴張時間約為12萬年前(95%CI: 7.9萬年—22.7萬年)。

3 討論

圖 3 基于Cytb基因全序列構建的松江鱸鄰接系統樹(外群為圖們江杜父魚和賴氏杜父魚)Fig.3 NJ phylogenetic trees based on Cytb gene complete sequences of T.fasciatus (C.Hangiongensis and C.Reinii as outgroup)

松江鱸8個群體的線粒體Cytb基因全序列中,共有38個變異位點、31單倍型, 單倍型多樣度為0.97, 呈現出較高的遺傳多樣性, 但其核苷酸多樣性僅為0.0059, 處于一個較低水平, 與劉海林等[16]對黃渤海松江鱸控制區序列研究的結果相一致, 這也符合Grant和Bowen[27]提出的海水魚類不同單倍型多樣性和核苷酸多樣性間的第二種類型, 即較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性。西北太平洋區域有些魚類如黃姑魚[28]、花鱸[29]和銀鯧[30]也具有這種類型的遺傳多樣性模式, 顯示該類型魚類群體可能經歷過歷史擴張事件, 即由一個較小的有效群體在短時間內快速成長為一個大的群體。在群體擴張的過程中, 隨著群體數量的增加, 單倍型多樣度會有所提高, 但沒有足夠的時間來積累核苷酸產生的變異, 因此會造成單倍型多樣度較高而核苷酸多樣度較低的遺傳多樣性模式[26]。

生物地理群之間基因流的阻隔和環境因子之間的差異可導致不同群體之間遺傳結構的顯著差異,當群體間存在較大的基因流時, 其遺傳分化不明顯。然而不同地區的生境差異是產生和保持地理群體間遺傳結構差異的重要因素[31]。在本研究中, AMOVA分析結果、單倍型鄰接樹和單倍型網絡關系圖均表明松江鱸中國沿海各群體和日本有明海群體間的遺傳差異顯著, 可明顯分為中國和日本兩大世系, 其結果與白姑魚[32]研究結果相似。基于核苷酸Kimura雙參數替代模型計算的松江鱸中國和日本兩個世系的凈遺傳距離達0.082, 表明中日兩個世系分歧時間約為41萬年以前, 其分化可能是受到更新世冰期的影響。很多研究者發現更新世冰期對于海洋魚類的群體遺傳結構產生了巨大的影響[29,33]。第四紀末期, 全球氣候經歷了一系列冰期-間冰期的變化, 在過去的約80萬年里, 氣候波動主要以一個約為10萬年的周期進行[34]。第五次冰期結束時間大約為42萬年前[35], 與松江鱸中日世系的分化時間相吻合。伴隨著第五次冰盛期的到來, 海平面下降約120—140 m, 松江鱸中國和日本群體可能會被隔離在相應邊緣海的避難所里; 冰期過后, 隨海平面上升, 被隔離的群體重新擴張, 但中日之間長距離的地理隔離和松江鱸幼體有限的擴散能力等原因導致其基因交流中斷, 隨著時間的推移, 中國松江鱸群體和日本群體逐漸分化成兩個不同的世系。然而,中國世系的松江鱸各群體之間沒有明顯的地理遺傳結構, 即各群體不存在顯著的遺傳差異, 與之前關于松江鱸ISSR、AFLP和線粒體控制區的研究結果[13—16]相一致。分析可能有以下原因: 松江鱸在中國沿海群體擴張的時間尚較晚, 群體缺乏足夠的時間在遷移和漂變之間取得平衡, 因此其各群體之間不存在顯著的遺傳分化[36]; 松江鱸繁殖和幼魚成長階段均在河口近海完成, 從2月到6月持續將近五個月[1], 此階段有可能隨海洋沿岸流被動擴散, 使不同群體基因交流的機會增加, 遺傳分化程度降低;其次, 松江鱸大都生活在河流至河口近海區域, 其生活的地理構架和環境因子相似, 且松江鱸屬廣溫廣鹽性種類, 不同地區的溫度和鹽度對其構成的選擇壓力不大, 因此其群體間的遺傳差異較小; 此外,松江鱸為一年生魚種, 近年來的增養殖也可能造成群體間的基因交流。將中國世系當作一個大的群體進行群體歷史動態分析, 中性檢驗的結果均為負值且顯著, 核苷酸不配對分布呈單峰型, 表明此群體歷史上曾經發生過群體擴張, 計算得到松江鱸中國世系的擴張時間大約為12萬年前。可能是末次冰期結束以后, 海平面上升后, 松江鱸的棲息地發生了大面積擴張, 導致其群體發生了擴張。

圖 4 基于簡約法構建的松江鱸單倍型網絡關系圖Fig.4 Median-networks showing genetic relationship among haplotypes of T.fasciatus based on parsimony method

遺傳多樣性不僅是生物多樣性的基礎和核心,也是生物物種進化潛能的保證[37], 遺傳多樣性的降低將導致物種對環境適應能力的下降, 復雜多變的生存環境將對其群體的生存產生重大的威脅。松江鱸的遺傳多樣性總體水平較高, 說明其資源量雖然銳減可能并未影響到遺傳多樣性, 若及時采取有效的保護策略, 其資源量恢復的潛在能力較大。研究結果顯示松江鱸中國群體和日本群體已經產生了一定的遺傳分化, 在不同研究結果難以獲得參比的情況下, 中國沿海的松江鱸是否作為一個隨機交配的群體進行管理需要謹慎對待。今后, 有必要采用其他分子標記(如SSR、AFLP、SNP等)對松江鱸群體結構及其遺傳多樣性狀況進行全面研究, 促進其資源的保護和可持續發展。

圖 5 松江鱸中國世系的核苷酸不配對分布圖(柱狀圖顯示觀測值, 曲線為群體擴張模型下的預期分布)Fig.5 Nucleotide mismatch distribution of T.fasciatus in Chinese lineage (Bars are the observed pairwise differences and solid line represents the expected mismatch distributions under the sudden expansion model)

表3 松江鱸中國群體中性檢驗、核苷酸不配對分布及擬合優度檢驗Tab.3 Neutral test, mismatch distribution of Nucleotide and test of goodness of fit of T.fasciatus populations in China

致謝:

吳建新、國寶富、郭棟、王茂林、宋林及日本九州大學鬼谷徳雄博士等幫助采集松江鱸樣品, 在此表示感謝。

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POPULATION GENETIC STRUCTURE OF ROUGHSKIN SCULPIN TRACHIDERMUS FASCIATUS BASED ON THE MITOCHONDRIAL CYTb SEQUENCE

GAO Tian-Xiang1, BI Xiao-Xiao1, ZHAO Lin-Lin1and LI Chuang-Ju2
(1.Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Jingzhou 434000, China)

Roughskin sculpin, Trachidermus fasciatus is a catadromous fish, and it is distributed along the coast of Northwest Pacific.The fish population has been greatly decreased in recent years due to degradation of habitats, water pollution and dam construction.In order to protect the fish population, it is necessary to study genetic structure of the fish population, which is very important for fishery management and conservation.Forty seven individuals used in this study were collected from 8 sampling locations in the coast of China and Japan, i.e., Hangzhou Bay (HZB), Wendeng (WD), Rongcheng (RC), Dongying (DY), Qinhuangdao (QHD), Dalian (DL), Dandong (DD) and Ariake Sea.The mitochondrial cytochromeb(Cytb) gene sequence ofT.fasciatuswas amplified by polymerase chain reaction (PCR) technology and sequenced on an automatic sequencer with both forward and reverse primers.The sequences were analyzed by using some software, which included Dnastar, Arlequin3.1, Mega4.0, Modeltest3.7 and Paup4.0.The results were as follows: the Cytb sequence of each specimen was 1141 bp and used for genetic diversity analysis.There was neither insertion nor deletion found among 38 mutations of nucleotide acids and 31 haplotypes were found among 47 individuals from 8 sampling sites.All 8 populations were characterized by high haplotype diversity (0.60—1.00) and low nucleotide diversity (0.0005—0.0041).The analysis result of molecular variance (AMOVA), median-networks and NJ phylogenetic trees showed that there was large genetic differentiation between those two regions, while there was no genetic variance among populations of the Chinese lineage.Net average genetic distance between two lineages was 0.82%.Applying divergence rate of Cytb gene sequence, the divergence of lineage China and Japan occurred about 410000 years ago.The mismatch distribution of pairwise nucleotide and the negatively selective neutrality test suggest that a recent population expansion had occurred in Chinese lineages, and the time was estimated to be about 120000 years before present (during the late Pleistocene).Two distinct lineages found inT.fasciatuswere probably related to the Pleistocene coastal glaciations and the long geographical distance.Dispersal ability, coastal currents and the population expansion may be responsible for the homegeneity among the Chinese populations.

Trachidermus fasciatus; Cytb gene; Complete sequence; Genetic structure; Population expansion

Q347

A

1000-3207(2013)02-0199-09

10.7541/2013.5

2011-12-28;

2012-10-29

海洋公益項目(201105005); 中國水產科學院長江水產研究所開放課題(LFBCU0713)資助

高天翔(1962—), 遼寧遼陽人; 博士; 主要從事漁業資源生物學及群體遺傳學研究。E-mail: gaozhang@ouc.edu.cn

李創舉, E-mail: lcj@yfi.ac.cn