急性熱應激對西伯利亞鱘HSP70 mRNA表達、血清皮質醇和非特異性免疫的影響

田照輝 徐紹剛 王 巍 胡紅霞 馬國慶

(國家淡水漁業(yè)研究中心暨北京市水產科學研究所, 北京 100068)

急性熱應激對西伯利亞鱘HSP70 mRNA表達、血清皮質醇和非特異性免疫的影響

田照輝 徐紹剛 王 巍 胡紅霞 馬國慶

(國家淡水漁業(yè)研究中心暨北京市水產科學研究所, 北京 100068)

為研究西伯利亞鱘(Acipenser baerii)對急性熱應激的抗逆機理, 將體質量為(155.47±19.50) g的魚從17.5 ℃迅速轉至27.5 ℃水中, 在1h和3h取樣測定HSP70 mRNA表達變化、血清皮質醇和非特異性免疫指標。結果顯示: 急性熱應激時鰓、脾和腦的HSP70 mRNA表達量升高, 具有組織特異性, 熱應激1h時鰓的表達量升高最快(P<0.05), 3h時保持1h時的表達水平; 脾和腦熱應激1h時表達量變化不顯著, 在1h至3h時升高較快, 并且腦組織的表達量升高最快(P<0.05)。熱應激1h時血清皮質醇(Cortisol)含量迅速升高(P<0.05), 之后快速回落。脾臟巨噬細胞呼吸暴發(fā)在熱應激1h時顯著升高(P<0.05), 3h時降低。血清補體C3在1h時略有升高, 3h時顯著性降低(P<0.05)。血清溶菌酶活性(LZM activity)先升高后降低差異不顯著。血清超氧化物歧化酶(SOD)活力隨熱應激時間延長逐漸降低, 3h時顯著降低(P<0.05)。血清丙二醛(MDA)含量隨熱應激時間延長逐漸降低, 差異不顯著。以上結果表明: 1h的短暫急性應激增強了西伯利亞鱘的非特異性免疫, 3h的應激使免疫力和抗氧化能力顯著下降; 在熱應激過程中,HSP70表達升高, 其中鰓組織最快, 起到應激保護作用, 提高了機體熱耐受力。

西伯利亞鱘; 急性熱應激;HSP70 mRNA表達; 皮質醇; 非特異性免疫

我國20世紀90年代成功開展鱘魚養(yǎng)殖并迅速推廣, 1998年到2002年鱘魚養(yǎng)殖增加了50倍[1], 鱘魚已成為山區(qū)流水和網箱養(yǎng)殖的重要品種。西伯利亞鱘(Acipenser baerii), 隸屬于鱘科, 鱘屬, 為軟骨硬鱗類, 是《瀕危動植物種國際貿易公約》附錄Ⅱ物種, 具有重要的科研和經濟價值。西伯利亞鱘為亞冷性魚類, 適宜生長水溫16.7—24.7℃[2]。魚類是變溫動物, 易受水溫變化的影響, 適應低溫的魚類,對熱更敏感[3], 高水溫抑制生長, 損害魚體健康甚至死亡[4]。西伯利亞鱘在高溫下難以存活或生長緩慢[5—7], 養(yǎng)殖條件受到限制, 夏季持續(xù)高溫應激造成鱘魚死亡現象時有發(fā)生。

適度的應激對機體有利, 過強和持續(xù)時間過長的應激對機體有害, 應激能打破魚類與環(huán)境間的平衡, 產生皮質類固醇濃度升高為特征的系列反應,進而引起其他生理和免疫反應的變化。魚類適應水溫變動的過程中, 顯著影響體內抗氧化體系[5,6]。熱休克蛋白(HSPs)可根據分子量分類, 其中HSP70家族高度保守, 研究最為深入, 對熱應激更敏感[8]。HSP70能提高細胞的應激耐受性[9—11], 增強抗氧化作用。鱘魚環(huán)境應激研究多為遭遇擁擠、氨氮、缺氧等時, 皮質醇和葡萄糖等生理指標的變化[12—15],但重要環(huán)境脅迫因子高水溫對西伯利亞鱘影響研究較少。本文系統研究了急性熱應激時西伯利亞鱘血清皮質醇、非特異性免疫和HSP70 mRNA表達變化,旨在闡明西伯利亞鱘對熱應激的抗逆機理, 為其耐高溫品種選育和提高耐高溫能力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗魚和取樣

試驗用西伯利亞鱘由北京市水產科學研究所國家級鱘魚良種場提供。挑選體質健壯的西伯利亞鱘15尾, 平均體質量為(155.47±19.50) g, 17.5℃暫養(yǎng)一周后, 5尾魚設為0h組, 其余迅速轉入27.5℃水中,進行熱應激。觀察魚的行為反應, 鰓蓋的張開閉合視為一次呼吸, 統計呼吸頻率。在熱應激后1h、3h分別迅速取5尾魚轉入1 g/L的丁香酚水中, 麻醉后尾靜脈取血, 4℃靜置2h, 4℃ 3000 r/min離心10min,取血清?20℃保存, 用于測定免疫指標和皮質醇。迅速取鰓、脾臟、全腦液氮速凍, ?80℃保存, 用于提取RNA。取新鮮脾臟用于測定呼吸暴發(fā)。

1.2 試劑、引物合成

RNeasy Mini Kit, RNase-Free DNase Set為Qiagen公司產品。RT-PCR試劑盒購于Invitrogen公司。實時定量試劑為AB公司的2×Sybrgreen PCR Master Mix。克隆菌株DH10B由北京市水產科學研究所生物技術與育種研究室保存。

根據西伯利亞鱘HSP70 cDNA全序列(GenBank: HM348777), 使用軟件Primer 5.0設計實時定量PCR引物4f: GTTACCCGAAGGACCCAATC, 4r: GT ATCCAGCATCACAAACAGAA, 由北京擎科生物工程有限公司合成。

1.3 HSP70 mRNA的實時定量

使用Qiagen RNA試劑盒提取總RNA, RNase-Free DNase set柱上處理基因組, 伯樂紫外分光光度計測定RNA的濃度和OD值, 保證OD值為1.9—2.0, 瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA完整性。采用SYBR Green法, 將待測樣品cDNA系列稀釋后作為標準品, 構建相對標準曲線, 按照田照輝等[16]方法進行實時定量。

1.4 皮質醇含量測定

取?20℃保存的血清, 由北方生物技術研究所使用皮質醇放射免疫分析藥盒(北方生物技術研究所生產, 國藥準字S10940097)測定: 標準或樣品中的皮質醇(簡稱Cor.)和加入的125I-Cor.共同與一定量的特異性抗體產生競爭性免疫反應。具體步驟見試劑盒說明書。

1.5 溶菌酶活力測定

參照宋超等[17]方法, 以溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)凍干粉為底物, 將底物用0.1 mol/L、pH 6.4的PBS緩沖液配成A540=0.3—0.5的懸液。取3 mL該懸濁液于試管內并置于冰浴中, 再加入50 μL待測血清, 混合, 測A0值。然后將試液移入37 ℃溫浴30min, 取出后立刻置于冰浴內10min, 以終止反應,測其A值。溶菌酶活力計算公式為: ΜL= (A0?A)/A。

1.6 呼吸暴發(fā)測定

參照Couso, et al.[18]方法, 采用NBT(氯化硝基四氮唑啉藍)還原法測定: 在無菌條件下取新鮮脾臟,加入RMPI 1640培養(yǎng)基制備單細胞懸液, 臺盼蘭染液顯微計數活細胞, 將活細胞濃度調整至107cell/mL, 取100 μL此懸液加入96孔板, 每個樣品3個平行, 空白對照加100 μL RMPI1640培養(yǎng)基。將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱, 18℃培養(yǎng)1h, 棄掉培養(yǎng)液(此時細胞已貼壁), 加入100 μL NBT繼續(xù)培養(yǎng)1h。棄掉NBT, 用PBS緩沖液沖洗后加2倍體積甲醇固定10min。棄掉甲醇, 加入2mol/L KOH 120 μL和DMSO140 μL, 在勻速振蕩器上300 r/min振蕩10min后, 用酶標儀測630nm吸光值。

1.7 SOD、MDA和補體C3測定

取?20℃保存的血清由北京華英生物技術研究所測定。其中SOD、MDA分別使用南京建成生物工程研究所超氧化物歧化酶(SOD)測試盒與微量丙二醛(MDA)測試盒, SOD采用黃嘌呤氧化酶法, MDA采用硫代巴比妥(TBA)法。C3采用濰坊三維生物工程集團有限公司試劑盒, 采用免疫比濁法。所用儀器均為日本日立7160全自動生化儀。

1.8 數據統計分析

實驗數據使用Spss11.5中One-way和Duncan’s進行單因素方差分析和多重比較。

2 結果

2.1 行為反應

西伯利亞鱘從17.5℃轉至27.5℃水中, 有明顯趨避行為, 劇烈游動, 呼吸頻率加快, 平均達210次/min, 0.5h后穩(wěn)定在180次/min, 0h保持在80—90次/min。

2.2 HSP70 mRNA表達

在西伯利亞鱘遭受熱應激時, 鰓的HSP70 mRNA表達量升高最快, 1h 后升高為0h組的1.63倍, 差異顯著(P<0.05), 直到3h時仍然保持在這一水平; 脾和腦熱應激1h后HSP70 mRNA表達量沒有變化, 但3h時升高較快, 差異顯著(P<0.05), 并且在熱應激后1h至3h時, 腦的HSP70 mRNA表達量升高最快, 3h時為1h時的1.77倍(P<0.05), 但低于鰓1h和3h時的表達量, 且差異顯著(P<0.05) (圖1)。

2.3 血清皮質醇含量

在急性熱應激狀態(tài)下, 血清皮質醇含量迅速升高, 1h時為0h時的5.14倍(P<0.05), 隨著熱應激時間延長, 皮質醇含量快速回落, 3h時為0h時的2.1倍(圖2)。

圖1 急性熱應激對西伯利亞鱘HSP70 mRNA表達的影響(n=5)Fig.1 The effect of acute thermal stress on HSP70 mRNA expression in Acipenser baerii (n=5)

圖2 急性熱應激對血清皮質醇變化Fig.2 The effect of acute thermal stress on serum cortisol content

2.4 非特異性免疫指標

在3h急性熱應激時間內, 脾臟巨噬細胞呼吸暴發(fā)(NBT反應強度)在1h時最高, 差異顯著(P<0.05), 3h時稍低于0h組水平, 差異不顯著(圖3)。血清補體C3在1h時有所升高, 但差異不顯著, 3h時顯著降低, 低于0h組水平(P<0.05)(圖4)。血清溶菌酶活性先升高后降低但差異不顯著(圖5)。血清超氧化物歧化酶SOD活性隨熱應激時間延長逐漸降低, 3h時顯著降低(P<0.05)(圖6)。血清丙二醛MDA含量隨熱應激時間延長逐漸降低, 差異不顯著。(圖7)

圖 3 急性熱應激對脾臟巨噬細胞呼吸暴發(fā)的影響Fig.3 The effect of acute thermal stress on respiratory burst of spleen macrophage

圖4 急性熱應激對血清C3含量的影響Fig.4 The effect of acute thermal stress on serum C3

圖5 急性熱應激對血清溶菌酶活性的影響Fig.5 The effect of acute thermal stress on serum lysozyme activity

圖6 急性熱應激對血清SOD活性的影響Fig.6 The effect of acute thermal stress on serum SOD content

圖7 急性熱應激對血清MDA含量的影響Fig.7 The effect of acute thermal stress on serum MDA content

3 討論

3.1 熱應激對HSP70 mRNA表達的影響

27.5℃水溫超出了鱘魚的適溫范圍[2], 是鱘魚養(yǎng)殖中夏季經常遭遇的高水溫。急性熱應激使西伯利亞鱘呼吸頻率加快, 增加了呼吸代謝, 行為適應不能保證內環(huán)境的穩(wěn)定時, 開始出現生理性應激反應[19]。上調熱休克蛋白表達是機體細胞對應激做出的反應之一[20], 使細胞免受變性蛋白的損害。在急性熱應激狀態(tài)下, 西伯利亞鱘鰓、脾、腦的HSP70 mRNA表達均有不同程度的上調, 呈現出組織特異性[11]: 1h內鰓HSP70 mRNA表達量升高最快; 1h至3h時腦組織的HSP70 mRNA升高最快, 3h時為1h時的1.77倍(P<0.05)。同扇貝(Chlamys farrer)、牡蠣(Ostrea edulis)等水生動物一樣[21]鰓組織比其他組織對水環(huán)境的改變更敏感, 這可能是鰓直接與水環(huán)境接觸造成的。黑頭呆魚(Pimephales promelas)腦引起應激的溫度高于鰓[20], 西伯利亞鱘腦組織在1h時的表達量基本沒有變化, 說明西伯利亞鱘腦組織較鰓組織難以引起熱應激, 這與黑呆頭魚較一致。腦內HSP70的過度表達與神經保護作用有關, 是神經元損傷的標志[22], 急性熱應激3h時西伯利亞鱘腦HSP70 mRNA表達量迅速增高, 說明腦組織已經出現了變性蛋白。

熱休克蛋白的誘導表達一般呈現先升高后降低的趨勢, 健康人中性粒細胞熱應激誘導后4—6h HSP70表達至高峰水平[23], 團頭魴(Megalobrama amblycephala)34℃熱應激下肝臟組織HSP70基因表達量6h達最大值[24]。文中西伯利亞鱘3種組織3h時HSP70 mRNA表達量呈上升趨勢, 不能判定已達高峰水平。HSP70誘導溫度和表達變化受魚的種類、組織特異性、飼育歷史等因素影響[25—27], 在使用HSP70評價應激狀態(tài)時應予以考慮。

3.2 熱應激對血清皮質醇含量的影響

鱘魚在遭遇脅迫時最先產生、最主要的類固醇激素是皮質醇[12]。雖然西伯利亞鱘血清皮質醇含量個體之間差異較大, 亞得利亞鱘(Acipenser naccarii)也存在此現象[28], 但血清皮質醇對溫度驟升反應迅速而強烈, 同其他硬骨魚一樣, 鱘魚血清皮質醇水平升高是應激反應初始指示器[28]。種屬、年齡、季節(jié)和水溫等均影響血清皮質醇水平[29], 亞得利亞鱘皮質醇含量25℃時是17℃時的2.5倍多, 根據Maxime, et al.[15]的觀點17℃靜息狀態(tài)是亞得利亞鱘魚的生理水平[28], 據此觀點西伯利亞鱘17.5℃時的皮質醇含量12.43 ng/mL可視為其生理水平, 高于3齡1.5 kg西伯利亞鱘的5 ng/mL[15]。Webb, et al.歸納了多種鱘魚皮質醇含量[12], 其中俄羅斯鱘魚(Acipenser guldenstadti)含量最高, 為33.5 ng/mL,高于文中西伯利亞鱘。

皮質醇具有促進葡萄糖異生作用, 適度和短時增高, 幫助機體對抗環(huán)境壓力[30]。但較高濃度和較長作用時間, 對頭腎巨噬細胞呼吸暴發(fā)產生抑制作用[31]。溫度突然升高時超過一般生理水平的皮質醇會引起胸腺、脾臟和淋巴組織萎縮, 抑制免疫[32]。每克體重50 μg皮質醇抑制虹鱒(Oncorhynchus mykiss)HSP70誘導產生[33]。實驗中西伯利亞鱘皮質醇在熱應激1h時迅速升高, 起到對抗環(huán)境壓力的作用, 在3h時已迅速回落, 各組織HSP70 mRNA的表達并沒有受到1h時皮質醇升高的抑制, 可能是因為皮質醇升高的時間較短。

3.3 熱應激對非特異性免疫的影響

呼吸暴發(fā)產生大量活性氧自由基, 發(fā)揮殺菌功能, 但過多的自由基會造成組織損傷。SOD酶最先與活性氧自由基發(fā)生作用, 清除自由基[19], 當SOD酶活性降低時, 體內會出現自由基過多, 免疫水平下降[34]。MDA為脂質過氧化產物, 反映機體受氧化損傷程度。中華鱘 (Acipenser sinensis Gray)低溫和適溫時血清活性氧含量隨水溫顯著升高[5], 西伯利亞鱘呼吸暴發(fā)在溫度驟升1h時顯著增加, 之后迅速降低, 可能因為27.5℃已超出了其適溫范圍, 并且HSP70表達增加可以抑制呼吸暴發(fā)功能[23]。西伯利亞鱘血清SOD在抗氧化過程中發(fā)揮重要所用: 在熱應激1h內, 呼吸暴發(fā)產生大量活性氧, 抗氧化系統通過SOD維持自身的穩(wěn)定, 隨著自由基清除劑消耗增多, 3h時SOD活力顯著下降, 標志著機體抗氧化能力顯著下降。MDA的含量呈下降趨勢但差異不顯著, 說明細胞膜還沒有受到損傷。

水生動物血清溶菌酶活力是衡量機體免疫狀態(tài)的指標之一。急性熱應激時西伯利亞鱘溶菌酶活性沒有受到顯著影響。補體是體液中一組具有酶原活性的糖蛋白, 活化后可參與免疫和維護內環(huán)境穩(wěn)定。硬骨魚類補體替代途徑具有比哺乳類補體替代途徑更為重要的作用[30], 補體替代途徑激活從C3開始。C3含量下降增加對疾病易感性[35]。西伯利亞鱘熱應激1h時C3含量顯著上升, 3h時含量顯著降低, 說明短時的熱應激提高了機體的免疫力, 較長時間的應激降低了機體的免疫力。

綜上所述, 急性熱應激顯著影響了西伯利亞鱘非特異性免疫和皮質醇含量, HSP70表達顯著升高,起到一定的應激保護作用, 鰓組織反應最快。1h的短暫急性應激使西伯利亞鱘皮質醇含量顯著升高,增加了糖異生作用, 呼吸暴發(fā)顯著升高, 補體C3和溶菌酶活性略有升高, 增強了西伯利亞鱘的抗應激能力和非特異性免疫能力; 3h的急性熱應激使西伯利亞鱘補體C3、呼吸暴發(fā)和SOD活性顯著降低, 西伯利亞鱘抗氧化能力和非特異性免疫顯著下降, 此時HSP70的誘導表達已難于維持機體自身的穩(wěn)態(tài)。

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EFFECTS OF ACUTE THERMAL STRESS ON HSP70 MRNA, PHYSIOLOGY AND NONSPECIFIC IMMUNITY IN SIBERIAN STURGEON (ACIPENSER BAERII)

TIAN Zhao-Hui, XU Shao-Gang, WANG Wei, HU Hong-Xia and MA Guo-Qing
(National Engineering Research Center for Freshwaters(Beijing)and Beijing Fisheries Research Institute,Beijing100068,China)

The effect of acute thermal stress onHSP70 mRNA expression, physiology and nonspecific immunity were investigated in Siberian sturgeon.In the experiment, ten fish were transferred from17.5℃ to 27.5℃ water, then data were measured at 1h and 3h.Fish in 17.5℃ water were taken as 0h group.Respiratory rate increased from 80—90 breaths/min to 210 breaths/min, then decreased to 180 breaths/min after 0.5h.Among the three tissues including gill, spleen and brain, theHSP70 mRNA expression in gill rose most quickly after 1h stress, and was about 1.63 fold compared with the 0h group (P<0.05), then remained this level to 3h; TheHSP70 mRNA expression in spleen and brain had nearly no change in 1h thermal stress, then rose quickly from 1h to 3h in the two tissues, especially in brain at 3h rose most quickly to about 1.77 fold compared with the 1h group (P<0.05).Compared with the 0h group, serum cortisol increased quickly and was 5.14 fold (P<0.05) at 1h, then decreased quickly to 2.1 fold at 3h.Spleen macrophage respiratory burst achieved the maximum (P<0.05) at 1h, then reduced to the 0h group level.Serum complement C3 increased at 1h and decreased significantly at 3h (P<0.05).Serum lysozyme activity firstly elevated then decreased but had no significant differences.Serum SOD activity decreased when thermal stress time prolonged, and achieved the minimum at 3h (P<0.05).Serum MDA content decreased when thermal stress time prolonged and had no significant difference.The results showed that 1h acute thermal stress promoted the nonspecific immunity and tolerance, but 3h acute thermal stress decreased it.

Siberian sturgeon (Acipenser baerii); Acute thermal stress;HSP70 mRNA expression; Coritsol; Nonspecific immunity

S917.4

A

1000-3207(2013)02-0344-07

10.7541/2013.25

2012-06-05;

2013-01-06

農業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(201003055-05); 北京市科技計劃(D121100003712002); 北京市農林科學院青年基金(QNJJ 201015)資助

田照輝 (1973—), 女, 河北保定人; 高級工程師, 碩士; 主要從事生物技術與育種研究。E-mail: tzhhui@126.com

胡紅霞(1972—), 女, 博士, 高級工程師; E-mail: huhongxia1@yahoo.com.cn