牛膝多糖對(duì)草魚免疫和抗氧化功能的影響

王紅權(quán)唐德約趙玉蓉王小娜金柏濤張 凱肖調(diào)義

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128; 2.大通湖天泓漁業(yè)股份有限公司, 益陽 413207)

牛膝多糖對(duì)草魚免疫和抗氧化功能的影響

王紅權(quán)1唐德約1趙玉蓉1王小娜1金柏濤1張 凱2肖調(diào)義1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128; 2.大通湖天泓漁業(yè)股份有限公司, 益陽 413207)

為探討在飼料中添加牛膝多糖(ABP)對(duì)草魚免疫和抗氧化功能的影響, 選取平均體重(88.13±0.76) g的健康草魚375尾, 隨機(jī)分成5個(gè)處理, 即基礎(chǔ)飼料組、0.05 %、0.10 %、0.20 %、0.40 % ABP添加組, 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)25尾魚, 飼養(yǎng)65 d。結(jié)果表明, 在飼料中添加ABP對(duì)草魚頭腎體指數(shù)影響不顯著(P>0.05), 對(duì)脾體指數(shù)影響顯著(P<0.05), 與對(duì)照組相比, 0.05 %、0.10 %、0.20 %和0.40%添加組脾體指數(shù)分別增加6.29% (P>0.05)、28.00% (P<0.05)、9.14%(P>0.05)和13.14% (P>0.05); 血液中NBT陽性細(xì)胞數(shù)隨著ABP添加量的增加呈增加的趨勢(shì), 但各組間差異不顯著(P>0.05); 在飼料中添加ABP對(duì)草魚血清白蛋白、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)含量和過氧化氫酶活影響不顯著(P>0.05), 顯著影響草魚血清總蛋白(TP)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、α-腫瘤壞死因子(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量(P<0.05)。與對(duì)照組相比, 0.40%添加組的TP和AKP分別增加24.64% (P<0.05)和33.56% (P<0.05); 0.20 %、0.40 %添加組的LZM活力分別增加34.97% (P<0.05)和31.21% (P<0.05), SOD活力分別增加27.28% (P<0.05)和22.41% (P<0.05); 飼料中隨著ABP添加劑量的增加, 各組血清ACP活性先增加后緩慢下降, MDA含量先下降后上升。與對(duì)照組相比, 0.20%、0.40 %添加組ACP活性分別增加15.33% (P<0.05)和11.10% (P<0.05), 0.05%、0.10 %、0.20 %及0.40%添加組MDA含量分別下降11.97% (P>0.05)、21.33% (P<0.05)、32.37% (P<0.05)和2.53% (P>0.05)。飼料中隨著ABP添加量的增加, 各組草魚血清TNF-α含量變化規(guī)律不明顯, 但與對(duì)照組相比, 0.20%添加組TNF-α含量顯著增加(P<0.05)。綜上所述, 在草魚基礎(chǔ)日糧中添加適量牛膝多糖可以提高草魚的免疫和抗氧化能力, 建議添加量為0.20%。

草魚; 牛膝多糖; 免疫功能; 抗氧化功能

現(xiàn)代高密度集約化養(yǎng)殖模式和生態(tài)環(huán)境的日趨惡化導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害滋生、養(yǎng)殖效益下降,嚴(yán)重阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展, 通過提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力來抵抗疾病的發(fā)生已成為目前研究的熱點(diǎn)。牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharide, ABP)是從莧科植物牛膝根中提取出的一種水溶性多糖。目前的研究結(jié)果顯示, ABP具有提高仔豬生長(zhǎng)性能, 改善豬肉品質(zhì), 提高機(jī)體免疫功能[1,2], 抗腫瘤[3]、降糖和保護(hù)腎臟[4,5]、抗炎[6]、抗凝血[7]、保肝[8]、治療哮喘[9]、抗衰老、抗氧化[10]、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)[11]等生理活性, 但這些研究主要集中在小鼠等試驗(yàn)動(dòng)物、畜禽或體外, 在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與免疫領(lǐng)域的研究尚屬空白。因此, 本試驗(yàn)以草魚為研究對(duì)象, 在其基礎(chǔ)日糧中添加不同質(zhì)量的ABP, 以期探討ABP對(duì)草魚免疫和抗氧化功能的影響, 為其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛膝多糖(是牛膝根的醇沉水提物, 經(jīng)測(cè)定多糖含量為50%), 購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。

草魚, 由大通湖天泓漁業(yè)股份有限公司漁場(chǎng)提供。

試驗(yàn)飼料, 根據(jù)草魚配合飼料營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 1024-1997)配制基礎(chǔ)飼料, 其配方及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)飼料為分別在基礎(chǔ)飼料中添加0%、0.05 %、0.10 %、0.20 %、0.40 %的牛膝多糖。所有飼料原料先粉碎至全部通過0.43 mm的篩, 然后按配方混合均勻, 制成直徑為2.0 mm的硬顆粒。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì), 根據(jù)日糧處理因素不同,設(shè)5個(gè)處理, 即基礎(chǔ)飼料組、0.05 %、0.10 %、0.20 %、0.40 % ABP添加組。選取平均體重(88.13±0.76) g的健康草魚375尾, 隨機(jī)分入5個(gè)處理, 每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)25尾魚。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前, 將所有試驗(yàn)用魚集中馴養(yǎng)10d, 待其適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境和試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)開始時(shí)將魚稱重分組, 根據(jù)體重調(diào)整至各組間差異不顯著(P>0.05),分別飼養(yǎng)于1 m×1 m×1 m網(wǎng)箱中, 為期65d。分別于每日上午8: 00和下午4: 00進(jìn)行投喂, 日投喂量為魚體重的2%—4%, 觀察并記錄試驗(yàn)魚的攝食及活動(dòng)狀況。試驗(yàn)期間, 不定期對(duì)網(wǎng)箱進(jìn)行清洗, 盡量排除外界因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。

1.4 樣品采集和指標(biāo)測(cè)定

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后, 停食24 h, 以網(wǎng)箱為單位稱重, 然后每箱隨機(jī)取接近平均體重的魚3尾, 丁香油麻醉后尾靜脈采血。血液分為兩部分, 一部分用肝素鈉抗凝, 用于四唑氮藍(lán)(Nitroblue tetrazolium, NBT)陽性細(xì)胞數(shù)的測(cè)定; 另一部分4℃冰箱靜置2 h, 3 000 r/min離心30 min, 吸取上層血清于?80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓蠓謩e于冰盤上解剖, 分離其脾臟、頭腎, 用4℃、0.65%生理鹽水洗去血液, 濾紙吸干水分, 稱重, 計(jì)算頭腎體指數(shù)和脾體指數(shù)。

頭腎體指數(shù)(Head Kidney Somatic Index, HKSI) (‰)=(頭腎濕重/魚體重)×1000

脾體指數(shù)(Spleen Somatic Index, SSI)(‰)=(脾臟濕重/魚體重)×1000

NBT陽性細(xì)胞數(shù)的測(cè)定, 參照Anderson, et al.[12]的方法: 每尾魚觀察計(jì)數(shù)6個(gè)視野, 取其平均值作為結(jié)果, 每處理檢測(cè)6尾魚。

溶菌酶 (Lysozyme, LZM) 活力的測(cè)定, 參見吳旋[13]的測(cè)定方法。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定、過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)活性采用化學(xué)比色法測(cè)定, 其試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所; 總蛋白(Total protein, TP)、白蛋白(Albumin, ALB)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生化試劑公司,借助BS-200全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定; α-腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1(Interleukin-1, IL-1)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)放射免疫分析藥盒購(gòu)自北京華英生物研究所, 用GC-1200γ放射免疫計(jì)數(shù)器測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS(V8)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析,經(jīng)單因子方差分析差異顯著的再利用LSD法進(jìn)行多重比較, 所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ), %)Tab.1 Formulation and nutrition composition of the basal diet(Air-dry basis, %)

2 結(jié)果

2.1 牛膝多糖對(duì)草魚頭腎和脾臟體指數(shù)的影響

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明(表2), 在飼料中添加牛膝多糖對(duì)草魚頭腎體指數(shù)影響不顯著(P>0.05), 對(duì)草魚脾體指數(shù)有顯著的影響(P<0.05), 與對(duì)照組相比, 0.05 %、0.10 %、0.20 %、0.40 % ABP添加組草魚的脾體指數(shù)分別增加6.29%(P>0.05)、28.00%(P< 0.05)、9.14%(P>0.05)和13.14%(P>0.05)。

2.2 牛膝多糖對(duì)草魚血液NBT陽性細(xì)胞數(shù)的影響

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明(表3), 草魚血液中NBT陽性細(xì)胞數(shù)隨著牛膝多糖添加量的增加呈增加的趨勢(shì),但各組間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 牛膝多糖對(duì)草魚血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的影響

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明(表4), 飼料中添加ABP對(duì)草魚血清白蛋白、IL-1、IL-6含量和過氧化氫酶活影響不顯著(P>0.05), 對(duì)草魚血清TP、AKP、ACP、LZM、TNF-α、SOD及MDA含量影響顯著(P<0.05)。與對(duì)照組相比, 0.40 %添加組的TP和AKP顯著升高(P<0.05), 分別增加24.64%和33.56%; 飼料中隨著ABP添加劑量的增加, 各組血清ACP活性先增加后緩慢下降, 與對(duì)照組相比, 0.20%、0.40%添加組的ACP分別增加15.33%(P<0.05)和11.10%(P<0.05);飼料中添加0.20%、0.40%ABP顯著增加草魚血清LZM和SOD活力(P<0.05), 與對(duì)照組相比, LZM活力分別增加34.97%(P<0.05)和31.21(P<0.05), SOD活力分別增加27.28%(P<0.05)和22.41%(P<0.05);隨著飼料中ABP添加量的增加, 各組血清MDA含量先下降后上升, 與對(duì)照組相比, 0.05%、0.10%、0.20%及0.40%添加組草魚血清MDA含量分別下降11.97%(P>0.05)、21.33%(P<0.05)、32.37%(P<0.05)和2.53%(P>0.05)。隨著飼料中ABP添加量的增加, 各組草魚血清TNF-α含量變化規(guī)律不明顯, 但0.20%添加組TNF-α含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05), 比對(duì)照組增加20.62%, 其他各組間TNF-α含量差異不顯著。

表2 牛膝多糖對(duì)草魚免疫器官指數(shù)的影響Tab.2 Effects of ABP on immune organs index of grass carp (‰)

表3 牛膝多糖對(duì)草魚血液NBT陽性細(xì)胞數(shù)量的影響Tab.3 Effects of ABP on NBT positive-cells in blood of grass carp

表4 牛膝多糖對(duì)草魚血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of ABP on serum immune and antioxidant indexes of grass carp

3 討論

頭腎和脾臟是水產(chǎn)動(dòng)物重要的免疫器官, 在免疫細(xì)胞生成和免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用。樸香淑等[14]研究認(rèn)為中草藥免疫促進(jìn)劑可以加速免疫組織細(xì)胞的增殖、分化和成熟, 從而升高魚類或其他動(dòng)物的免疫器官重量, 增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。劉紅柏等[15]研究表明, 茯苓多糖能顯著增加鯉魚的脾體指數(shù);林旋等[16]在基礎(chǔ)日糧中添加黃芪多糖, 結(jié)果顯示魚體免疫器官指數(shù)都有相應(yīng)程度地提高。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 飼料中添加牛膝多糖對(duì)草魚的頭腎體指數(shù)影響不顯著(P>0.05), 但能增加其脾體指數(shù), 并且在0.10%添加時(shí)達(dá)到顯著水平(P<0.05)。這說明飼料中添加適量的牛膝多糖可以促進(jìn)草魚免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育, 從而增強(qiáng)其機(jī)體的免疫能力。

血液學(xué)指標(biāo)是動(dòng)物體生理學(xué)、病理學(xué)以及毒理學(xué)的重要指標(biāo), 常用來評(píng)價(jià)魚類健康、營(yíng)養(yǎng)及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。血清中的ALB和TP含量是機(jī)體吸收、合成及分解蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀況的標(biāo)志性反映, 也是機(jī)體免疫水平的反映[17]。溶菌酶在引發(fā)和維持機(jī)體防御免疫的過程中起著重要的作用, 在機(jī)體免疫過程中除了溶解細(xì)菌細(xì)胞壁外, 還可誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成與分泌[18]。酸性磷酸酶是溶酶體酶系的標(biāo)志酶, 直接作用于磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移, 參與能量轉(zhuǎn)化和信號(hào)傳導(dǎo)等, 有利于磷酸二腺苷和磷酸三腺苷的合成, 進(jìn)而提高機(jī)體非特異性免疫水平和營(yíng)養(yǎng)代謝水平[19]; 堿性磷酸酶是一種在堿性條件下具有較高活力的膜結(jié)合酶, 也是溶酶體的一部分, 在堿性介質(zhì)中可通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞降解, 其活力高低與動(dòng)物的生長(zhǎng)速度與生產(chǎn)性能密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果表明, 在草魚飼料中添加適量的牛膝多糖, 可以有效地提高草魚血清TP含量和LZM、ACP、AKP活力, 其中TP含量在牛膝多糖添加量為0.40%時(shí)最高; LZM活力在牛膝多糖添加量為0.20%和0.40%時(shí)顯著高于對(duì)照組; ACP活力在牛膝多糖添加量為0.20%時(shí)效果最為顯著, AKP活力在添加量為0.40%時(shí)效果最為顯著。陳清華[1]研究也表明, 斷奶仔豬日糧中添加適宜水平的牛膝多糖能顯著提高仔豬血清AKP活力。這說明適宜的牛膝多糖可以通過顯著升高草魚血清TP含量,提高草魚血清LZM、ACP、AKP活力來提高其非特異性免疫能力。

TNF-α是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子, 主要由淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌, 能激活巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞, 促進(jìn)抗原活化和T、B淋巴細(xì)胞增殖分化, 促進(jìn)某些細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素、干擾素以及TNF-α等細(xì)胞因子, 發(fā)揮重要的免疫促進(jìn)作用[21]。IL-1和IL-6形成于免疫反應(yīng)早期, 在機(jī)體免疫應(yīng)激中起主導(dǎo)作用[22]。研究表明: 牛膝多糖及其衍生物能夠顯著誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和TNF-α, 極大地發(fā)揮其免疫促進(jìn)作用[23]; 顯著誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)[24]; 顯著誘導(dǎo)斷奶仔豬外周血及脾淋巴細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá), 顯著增加斷奶仔豬血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量[25]。本研究結(jié)果表明, 在草魚日糧中添加牛膝多糖并沒有顯著影響其血清中IL-1和IL-6的含量, 但飼料中ABP添加量為0.20%時(shí), 受試草魚血清TNF-α含量顯著高于對(duì)照組。這說明飼料中添加適宜的牛膝多糖可通過促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞因子的表達(dá)來提高機(jī)體的特異性免疫, 從而增強(qiáng)機(jī)體的抗感染和抗病能力。

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)存在一套完整有力的抗氧化系統(tǒng),其中包括酶類和非酶類清除機(jī)制。酶類系統(tǒng)主要包括SOD, GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)和CAT等。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一, 在清除自由基(如O2?、-OH 等)、防止生物分子損傷等方面具有十分重要的作用[26]。本研究結(jié)果表明, 飼料中牛膝多糖的添加量為0.20%和0.40%時(shí), 草魚血清的SOD總活力顯著升高, 并且以0.20%添加時(shí)作用效果最為顯著; 飼料中隨著牛膝多糖添加水平的增加, 草魚血清過氧化氫酶活力先增加后下降, 與對(duì)照組相比, 添加量為0.20%時(shí)效果達(dá)顯著水平。MDA是脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)的最終產(chǎn)物, 其含量的變化能準(zhǔn)確地反映出機(jī)體抗氧化能力的變化, 且在一定程度內(nèi)呈負(fù)相關(guān)[27]。本研究結(jié)果顯示, 隨著飼料中ABP添加量的增加, 各組草魚血清MDA含量先下降后上升。與對(duì)照組相比, 添加量為0.20%時(shí), 草魚血清MDA含量降低的效果最為顯著。這說明草魚飼料中添加適宜水平的ABP可以提高草魚的抗氧化功能,減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明, 在草魚基礎(chǔ)飼料中添加適量

的牛膝多糖, 可以促進(jìn)草魚免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育,提高草魚血清TP、TNF-α含量和AKP、ACP、LSZ、SOD及CAT酶活, 從而提高草魚的免疫功能和抗氧化功能。推薦草魚飼料中ABP的適宜添加水平為0.2%。

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EFFECTS OF DIETARY ACHYRANTHES BIDENTATA POLYSACCHARIDE ON IMMUNITY AND ANTIOXIDANT FUNCTION OF GRASS CARP CTENOPHARYNGODON IDELLUS

WANG Hong-Quan1, TANG De-Yue1, ZHAO Yu-Rong1, WANG Xiao-Na1, JIN Bo-Tao1, ZHANG Kai2and XIAO Tiao-Yi1
(1.College of Animal Science and Technology, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2.Datonghu Tianhong Aquatic Products Co., Ltd., Yiyang 413207, China)

To investigate effects ofAchyranthes bidentatapolysaccharide (ABP) on immunity and antioxidant function of grass carps, five test groups were used, which consisted of control group, 0.05%, 0.10 %, 0.20 % and 0.40 % ABP addition group.375 grass carps with similar body weight (88.13±0.76) g were randomly allotted to five groups with three replicates and with 25 grass carps in each replicate and were fed for 65d.The results showed as follows: compared with the control group, 0.20% ABP addition significantly increased the contents of serum tumor necrosis factor-α (TNF-α), the activities of serum superoxide dismutase (SOD), acid phosphatase (ACP) and lysozyme (LZM) (P<0.05), significantly decreased the contents of serum malondialdehyde (P<0.05).0.40% ABP addition significantly increased the contents of serum total protein (TP) and the activities of serum alkaline phosphatase (AKP).0.10% ABP addition significantly increased spleen somatic index of grass carp.However, the number of Nitroblue tetrazolium (NBT) positive cells, the contents of serum albumin (ALB), interleukin 1(IL-1) and interleukin 6 (IL-6) were not significantly affected by ABP supplementation (P>0.05).These results indicate that dietary appropriate ABP can significantly promote immunity and antioxidant function of grass carps.We suggest that the appropriate ABP content was 0.20 % in feed of grass carp.

Grass carp; Achyranthes bidentata polysaccharide; Immunity; Antioxidant function

S965.1

A

1000-3207(2013)02-0351-07

10.7541/2013.26

2012-11-19;

2012-12-28

湖南省自然科學(xué)基金(09038); 國(guó)家農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系國(guó)家大宗淡水魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系常德綜合試驗(yàn)站(CARS-46-42)資助

王紅權(quán)(1971—), 男, 湖南湘陰縣人; 博士; 研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物健康養(yǎng)殖。Email: whq1078@yahoo.com.cn

趙玉蓉, 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。Email: zyr36@yahoo.com.cn; 肖調(diào)義, E-mail: tyx1128@yahoo.com.cn