密碼子優化提高aiiaB546畢赤酵母表達活性

張宇婷曹雅男解綬啟周志剛

(1. 中國農業科學院飼料研究所, 農業部飼料生物技術重點開放實驗室, 北京 100081; 2. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072)

密碼子優化提高aiiaB546畢赤酵母表達活性

張宇婷1曹雅男1解綬啟2周志剛1

(1. 中國農業科學院飼料研究所, 農業部飼料生物技術重點開放實驗室, 北京 100081; 2. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072)

N-酰基高絲氨酸內酯酶是一類特異性降解N-酰基高絲氨酸內酯類信號分子(AHLs)的蛋白水解酶, 通過水解AHLs生成酰基高絲氨酸, 使AHLs失去活性, 從而阻斷病原菌的群體感應路徑, 使病原菌失去致病能力, 其廣泛存在于多種微生物中[1,2]。近年來N-酰基高絲氨酸內酯酶作為一種新型抗菌策略(群體感應淬滅策略)的工具酶而成為水產養殖防治細菌性疾病研究的熱點[3—5]。

本研究室陳瑞東等在畢赤酵母中成功表達了Bacillus sp. B546來源的N-酰基高絲氨酸內酯酶基因(aiiaB546),得到的重組酶具有良好的pH適性和穩定性以及抗大多數金屬離子和蛋白酶的能力, 適合水產養殖條件, 經3.7 L發酵罐高密度發酵, 其表達量大幅提升, 使低成本獲得大量的AiiaB546成為可能, 并且以酶制劑的形式通過活體注射的方式成功衰減了嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila ATCC 7966)在錦鯉(Cyprinus carpio)中的致死能力。根據所知, 這是首次在畢赤酵母中高效表達N-酰基高絲氨酸內酯酶并通過注射該酶衰減嗜水氣單胞菌的毒力。因此本實驗具有潛在的抗菌策略探討及水產養殖應用的價值, 但為了大量獲得廉價可商業化的N-酰基高絲氨酸內酯酶, 進一步提高生物反應器的表達酶活顯得尤為必要。

由于遺傳密碼具有簡并性, 一種氨基酸可以有1—6個使用頻率不同的同義密碼子。對于特定的物種, 高表達的基因往往使用部分特定的同義密碼子, 這些密碼子被認為是該物種高表達基因的優越密碼子, 這種現象稱為密碼子偏愛性。密碼子的偏愛性使得克隆的外源基因往往難以在異種生物細胞高效表達。在酵母中獲得高效表達的外源基因往往都是酵母偏愛密碼子所編碼的基因, 通過對酵母基因使用密碼子的統計分析證實所有的61個密碼子中有25個是酵母所偏愛的, 因此對密碼子進行偏愛性改造能大量提高重組蛋白在該系統中的表達量[6]。

本研究旨在嘗試通過密碼子優化提高N-酰基高絲氨酸內酯酶基因aiiaB546在畢赤酵母中的表達活性。

1 材料與方法

1.1 質粒與菌株

大腸桿菌 (Escherichia coli) DH5α購自北京全式金生物技術有限公司, 表達菌株畢赤酵母GS115和表達載體pPIC9購自Invitrogen公司, KYC55指示菌為本實驗室保存。

1.2 其他材料

方格紙：邊長為18 cm的正方形紙上排列22個長方形, 每個長方形的長為15個小方格, 寬為2個小方格, 每個小方格為邊長4 mm。

ATmm鹽溶液：KH2PO40.079 mol/L, NaOH 0.044 mol/L, (NH4)2SO40.015 mol/L, MgSO4·7H2O 0.6mmol/L, CaCl20.06 mmol/L, FeSO4·7H2O 0.027 mmol/L, MnSO4·H2O 0.007 mmol/L。

ATmm固體培養基：葡萄糖0.75 g,瓊脂粉3 g,超純水138 g,滅菌冷卻后加入ATmm鹽溶液15 mL, X-gal溶液200 μL。

3-oxo-C8-HSL購自Sigma公司, 內切酶均購自TaKaRa公司, T4連接酶為NEB公司產品。

1.3 基因aiiaB546M的設計改造及全合成

根據酵母密碼子偏好性[6], 對高絲氨酸內酯酶成熟肽段的編碼序列進行密碼子優化, 并且使GC含量保持適中。優化后的序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司進行全合成, 并與pUC57載體連接。

1.4 aiiaB546M- pPIC9表達載體的構建

小量提取質粒aiiaB546M-pUC57和質粒pPIC9, 用限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切, 電泳后回收aiiaB546M連接到同樣進行雙酶切的空載體pPIC9中, 將連接后的質粒轉化大腸桿菌DH5α, AOX通用引物驗證、測序、獲得重組載體aiiaB546M-pPIC9, 經BglⅡ酶切后電擊轉化畢赤酵母GS115感受態細胞, 涂布MD平板。

1.5 目的基因在畢赤酵母中的高效表達

挑取200個單克隆接種于3 mLBMGY培養液中, 30℃振蕩培養48h; 3250 r/min離心5min去上清, 加入1 mLBMMY培養液誘導48h。將培養液10000 r/m離心5min, 收集上清液, 檢測N-酰基高絲氨酸內酯酶活性,選擇有活性的菌株進行菌落PCR驗證, 正確后篩選酶活最高的陽性重組子。

1.6 陽性重組子中N-酰基高絲氨酸內酯酶活性的檢測

按照參考文獻[4], 采用瓊脂平板擴散法檢測N-酰基高絲氨酸內酯酶活力, 取20 μL蛋白液加入179 μL 0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH8.0)和1μL 1mg/mL的3-oxo-C8-HSL混合搖勻, 30℃溫育30min后, 加入50 μL 10% SDS水溶液終止反應得到反應液, 對照液為反應終止后再加入20 μL熱滅活酶液。取10 μL反應液(對照液)滴至膠條上, 30℃培養24h后計數變藍點數, 計算距離, 按酶活計算公式計算待測溶液的酶活。

1.7 密碼子優化前后表達水平及酶活力的比較

按照1.5所述的方法, 將未進行密碼子優化的原基因aiiaB546連接pPIC9載體后, 轉化畢赤酵母GS115感受態細胞, 挑取200個單克隆, 誘導后選擇酶活最高的菌株為對照, 與改造后的重組菌株在相同條件(接種量、培養及誘導時間、儀器設備)下進行誘導表達, 通過考馬斯亮藍法測定兩組樣品酶液中的蛋白含量, 比較二者的酶活力, 重復三次取平均值。SPSS 11.0軟件進行ANOVA方差分析, 顯著性臨界值設定0.05。

2 結果

2.1 aiiaB546M基因的全合成

aiiaB546M基因成熟肽編碼序列全長753 bp, 密碼子優化時, 在氨基酸序列保持不變的前提下, 共改變了155個堿基, GC含量由45.18%下降到41.38%, 基本符合畢赤酵母GC含量特征[6](圖1)。基因合成后克隆到載體pUC57上, 得到重組質粒aiiaB546M-pUC57。

2.2 含aiiaB546M基因的重組表達載體的構建

載體pPIC9和重組質粒aiiaB546M-pUC57都用EcoRⅠ和Not Ⅰ雙酶切(圖2), 回收后連接, 得到重組畢赤酵母表達載體aiiaB546M- pPIC9。

2.3 表達N-酰基高絲氨酸內酯酶的重組畢赤酵母菌株的

篩選

aiiaB546M- pPIC9經BglII酶切后, 電擊轉化畢赤酵母GS115菌株, 按1.5和1.6所述方法篩選得到高效表達N-酰基高絲氨酸內酯酶的重組畢赤酵母GS115-aiiaB546M,每個重組菌株設兩個平行(圖3)。

2.4 密碼子優化前后蛋白濃度及酶活力的比較

經測定, 密碼子優化前后N-酰基高絲氨酸內酯酶的蛋白濃度分別為1.37 mg/mL和1.54 mg/mL, 酶活力分別為33.1 U/mL和36.2 U/mL, 可以看出經密碼子優化后,蛋白表達量提高了12.4% (*P<0.05), 酶活性提高了9.5% (*P<0.05)。

3 討論

高效表達N-酰基高絲氨酸內酯酶是進一步提高該酶發酵效價、降低生產成本的新的有效途徑。來源于Bacillus的AiiaB546是迄今所報道的首次可以在畢赤酵母中表達的N-酰基高絲氨酸內酯酶, 且具有很好的熱穩定性、金屬離子抗性及抗蛋白酶降解能力, 經畢赤酵母表達的該酶和嗜水氣單胞菌共注射錦鯉可以較明顯地降低錦鯉死亡率和延遲半數致死時間, 而只注射該N-酰基高絲氨酸內酯酶對錦鯉無害[3]。在水產養殖防治嗜水氣單胞菌引起的疾病中, 注射或潛在的飼喂N-酰基高絲氨酸內酯酶可能成為一種替代抗生素的方法[7]。本文將aiiaB546基因進行改造后在畢赤酵母中實現了高效表達, 搖瓶誘導條件下的最高酶活力達到36.2 U/mL, 而相同條件下原基因(aiiaB546)重組質粒aiiaB546-pPIC9轉化畢赤酵母GS115重組菌的酶活力為33.1 U/mL, 顯然經密碼子優化后, 該酶在搖瓶水平的表達活性有了明顯提高, 但仍需進行小試及中試發酵水平的驗證以確認此改善幅度的實際價值。

圖1 密碼子優化前后基因的比對Fig. 1 The gene before and after codon optimization

圖2 雙酶切后的aiiaB546M基因和pPIC9載體Fig. 2 The gene aiiaB546M and vector pPIC9 after digestion with EcoRI and NotI

根據表達宿主的密碼子偏愛性對外源基因的密碼子進行優化, 是提高外源基因表達量的一種有效方法[8,9], 畢赤酵母表達系統在密碼子使用上的偏愛性在翻譯水平影響外源基因的表達, 尤其是稀有密碼子密集區往往成為制約翻譯速率及表達水平的因素。本研究將aiiaB546基因中所有低偏愛性密碼子及大部分中等偏愛性密碼子替換為高偏愛性密碼子, 使其在畢赤酵母中的表達量與活性分別較優化前提高了12.4%和9.53%。

圖3 重組畢赤酵母GS115-aiiaB546M高酶活菌株的篩選Fig. 3 Screen of recombinant GS115-aiiaB546Mstrain with high enzyme activity

另外, 增加外源基因在畢赤酵母染色體上整合的拷貝數也是提高外源蛋白表達量的有效方式[10], 本研究室正在對N-酰基高絲氨酸內酯酶進行這方面的嘗試。

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THE N-ACYL-HOMOSERINELACTONASE-XYLANASEGENE AIIAB546 REACHED A HIGHER EXPRESSION LEVEL BY CODON OPITIMIZATION IN PICHIAPASTORIS

ZHANG Yu-Ting1, CAO Ya-Nan1, XIE Shou-Qi2and ZHOU Zhi-Gang1
(1. Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, State Key Laboratory for Freshwater Ecology and Biotechnology, Wuhan 430072, China)

N-酰基高絲氨酸內酯酶; 密碼子優化; 酵母表達

N-acyl-homoserinelactonase; Codon optimization; Yeast expression

Q786

A

1000-3207(2013)01-0164-04

10.7541/2013.164

2011-12-20;

2012-11-01

十二五國家科技支撐計劃項目(2012BAD25B00); 天津市農業科技成果轉化與推廣項目(201004040); 北京市鱘魚、鮭鱒魚產業技術體系; 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室開放基金(2011FB05)資助

張宇婷(1986—), 女, 內蒙古呼和浩特人; 碩士研究生; 主要從事水產微生物基因工程研究。E-mail: zhangyt_1986@ sina.com

周志剛, E-mail: zhou_zg@msn.com