南極衣藻谷胱甘肽-S-轉移酶基因的表達及其對大腸桿菌低溫耐受性的增強作用

彭躍躍丁 燏,王金慧簡紀常,魯義善,劉 瑩

(1. 廣東海洋大學水產學院, 湛江 524025; 2. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室, 湛江 524025; 3. 廣東省教育廳水產經濟動物病害控制重點實驗室, 湛江 524025)

南極衣藻谷胱甘肽-S-轉移酶基因的表達及其對大腸桿菌低溫耐受性的增強作用

彭躍躍1,2丁 燏1,2,3王金慧1,2簡紀常1,2,3魯義善1,2,3劉 瑩1,2

(1. 廣東海洋大學水產學院, 湛江 524025; 2. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室, 湛江 524025; 3. 廣東省教育廳水產經濟動物病害控制重點實驗室, 湛江 524025)

谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione-S-transferase, GST, EC2.5.1.18)是生物體內一種重要的抗氧化酶, 為闡明GST在南極衣藻(Chlamydomonas sp. ICE-L)中的具體地位, 采用實時熒光定量PCR對不同溫度下南極衣藻的GST基因的表達進行了分析; 并構建了原核表達載體pET28a(+)-GST, 轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達, 通過平板培養法探討了重組菌E. coli BL21(pET28a(+)-GST)對低溫脅迫的耐受性。結果顯示, GST在0℃時表達量最高, 最高可達對照組的兩倍多; pET28a(+)-GST重組表達載體在E. coli BL21中實現了高效表達, 且主要以包涵體形式存在, 經HisTrap HP柱分離純化獲得高純度的GST融合蛋白, 并通過SDS-PAGE及Western blot分析得以驗證; 對低溫脅迫實驗發現南極衣藻GST蛋白的表達可以提高重組菌E. coli BL21對低溫的耐受性, 說明GST基因對南極衣藻適應南極低溫環境具有重要作用。

南極衣藻; 谷胱甘肽-S-轉移酶; 表達; 低溫

谷胱甘肽-S-轉移酶(GST: EC2.5.1.18)是一種多功能酶, 廣泛存在于各種動物、植物及微生物中, 分子量主要介于23—29 kD之間。根據其基因組織結構和序列的相似性, GSTs分為6類: phi、tau、lambda、theta和zeta及脫氫抗壞血酸還原酶(DHARs)[1], 前3類是植物所特有, 主要在植物的初級代謝和次級代謝、脅迫耐受和細胞信號轉導中起作用[2], 其中在各種脅迫中主要通過清除因脅迫產生的過氧化物(過氧化氫、過氧酸鹽)等物質起作用[3]。已有的研究表明, GST的過量表達可以增強蘆葦(Phragmites australis)對Cd2+的耐受性, 并具有阻止細胞凋亡的作用[4]; 在擬南芥(Arabidopsis)中GST在多種脅迫(如傷害[5]、乙烯利[6]、生長素[7]、過氧化氫(H2O2)和水楊酸[8])應答中均起著重要的作用; 梨形環棱螺肝臟和鰓的GST酶活性受一定濃度Cu2+的誘導作用[9]。 GST對植物適應低溫環境也有一定的作用, 橡膠樹(Hevea brasiliensis)GST基因的表達明顯受低溫的調控[10]; 冷脅迫能夠在轉錄和翻譯水平上引起甘薯(Ipomoea batats. L)GST的響應, 協助保護組織免受傷害[11]; 生長于寒冷環境中野生馬鈴薯(Solanum commersonii)GST基因的表達量比低溫敏感馬鈴薯高[12]; 云杉卷葉蛾(Choristoneura fumiferana)GST基因在轉基因擬南芥中的表達可以增強擬南芥對低溫的耐受性[13]; GST基因的過量表達可以促進轉基因水稻在低溫中的發芽和生長[14]。南極衣藻(Chlamydomonas sp. ICE-L)是生活在南極海冰表面、內部和底部一類微型單胞藻類, 嚴寒是南極環境一個最基本的特征。前期研究發現南極衣藻谷胱甘肽相關酶對其適應南極嚴寒環境具有一定的作用[15], 在蛋白水平上南極衣藻GST的活性與溫度密切相關[16]。本研究旨在進一步從分子水平上分析南極衣藻GST基因表達與溫度的關系, 同時構建了pET- 28a(+)-GST重組表達載體, 從原核水平上檢測南極衣藻GST基因的表達能否提高宿主菌E. coli BL21對低溫的耐受性, 為后續關于GST在抗低溫及其他抗逆研究中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RNA提取試劑TRIZOL?Reagent購自Invitrogen公司, dNTPs、ExTaq酶、rTaq酶及Reverse Transcriptase M-MLV(Rnase H-)均購自TaKaRa公司, TransStartTMGreen qPCR SuperMix購自北京全式金公司, 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物技術有限公司, 鼠抗His·tag單抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司, NC膜購于PALL公司。

本實驗對象南極衣藻(Chlamydomonas sp. ICE-L)由國家海洋局第一海洋研究所海洋生物活性物質重點實驗室提供。E. coli BL21(DH5α)、pET-28a(+)質粒由廣東海洋大水產學院廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室保存。

1.2 GST在不同溫度下的定量分析

采用Provasoli培養基培養南極衣藻, 溫度為4—8℃, 光強為1300—1900 lx, 光照周期為12h∶12h, 不充氣, 每天搖3—4次。將藻培養液分別置于0℃、8℃、14℃培養, 各溫度組均設3個平行, 并在0、6、12、24、36、48、72h分別收集藻體。按TRIZOL?Reagent試劑的操作程序稍加改動提取總RNA, 經DNase I消化后用Reverse Transcriptase M-MLV (Rnase H?)和oligodT18按照M-MLV說明書合成cDNA一鏈。以β-action為內參[17], 進行熒光定量PCR擴增。取2 μL上述稀釋20倍后的cDNA一鏈作為模板, 反應體系25 μL包括: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 12.5 μL和10 mmol/L的上下引物各1 μL以及8.5 μL ddH2O, PCR反應程序為: 94℃預變性5min, 94℃ 20s, 58℃ 20s, 72℃ 20s,進行40個循環, 最后72℃延伸30s。應用iQTM5 Optical System Software, 采用2?ΔΔCt法進行目標基因的熒光定量分析, 應用SPSS 17.0軟件對獲得的實驗數據進行統計學分析, **表示與同期對照組相比差異極顯著(P<0.01), *表示與同期對照組相比差異顯著(0.01< P<0.05)。

1.3 pE T-28a(+)-GST原核表達載體的構建、表達以及條件的優化

根據本實驗室在GenBank所提交的南極衣藻GST基因序列(登錄號: HQ444265)設計特異引物對其開放閱讀框(ORF)進行擴增。F1: 5′-CGCGGATCC ATGCGAGCTGCTCTGCGT-3′(BamH I), R1: 5′-ACGC GTCGAC CTACGTAGCCCTTGATGCCA-3′(Sal I), 在上、下游引物分別引入BamH I和Sal I酶切位點。以cDNA一鏈為模板進行PCR(94℃ 5min, 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 1min, 72℃ 5min)擴增, PCR產物和空質粒pET-28a(+)分別用BamH I、Sal I酶切, 并回收目的片段和線性化載體, T4DNA連接酶16℃連接過夜, 構建的表達載體pET-28a(+)-GST轉化至BL21(DE3)中。陽性克隆經酶切鑒定后送上海生工測序驗證。

將含有pET-28a(+)-GST的BL21接種于含50 μg/mL卡那霉素(Kan+)的LB培養液中, 37℃振蕩培養過夜, 將此培養物按1∶50的體積比添加到LB(Kan+)中, 分別在18℃、28℃、37℃培養至A6000.4—0.6, 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 誘導4h后, 取菌液10 mL, 10000 r/min離心1min, 加入500 μL 1×PBS(KH2PO40.2 g, Na2HPO4·12H2O 2.9 g, NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g, pH 7.4)重懸沉淀后冰浴超聲波破碎,離心收集上清和沉淀, 沉淀用1×PBS重懸浮, 分別吸取20 μL上清和重懸浮沉淀加入2×上樣緩沖液,煮沸5min, 進行12% SDS-PAGE電泳分析。對IPTG濃度的優化, 37℃下培養重組菌至A6000.4—0.6時加入IPTG至終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmoL/L進行誘導4h; 對于時間的優化, 添加同濃度的IPTG誘導0、1、2、3、4、5、6h后分別取樣分別進行12%SDS-PAGE電泳分析。

1.4 pE T-28a(+)-GST表達蛋白的純化以及western blot鑒定

按最佳誘導條件大量誘導(100 mL)重組表達蛋白, 離心收集菌體, 1×PBS重懸菌體, 超聲破碎, 工作時間8s, 間隔9s, 30min。離心收集沉淀, 分別用Washing buffer (Triton-100 0.5%, Tris-HCl 50 mmol/L pH 8.0, NaCl 300 mmol/L, EDTA 10 mmol/L, DTT 10 mmol/L)洗滌兩次、Resuspension buffer (Tris-HCl 50 mmol/L pH 8.0, NaCl 100 mmol/L, EDTA 10 mmol/L, DTT 10mmol/L)洗滌一次, 離心收集沉淀用8 mol/L尿素過夜溶解沉淀。離心收集上清用HisTrap HP 1 mL進行純化。純化蛋白經SDS-PAGE電泳后, 然后進行蛋白質電轉移, 將凝膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素膜上(轉移條件100V, 150min), 轉移完畢膜用5%脫脂奶粉Tris緩沖鹽-吐溫溶液(TTBS)室溫封閉過夜; 次日用TTBS緩沖液洗滌3次后用鼠抗His·tag單抗37℃孵育1h; 再用TTBS洗膜3次, 再用辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG37℃孵育1h;再用TTBS洗膜3次, 用DAB顯色至目的條帶清晰后立即以ddH2O終止反應。

1.5 重組菌BL21(pET-28a(+)-GST)的耐低溫分析

將重組菌E. coli BL21(pET-28a(+)-GST)接種于LB(Kan+)液體培養基中培養, 當A600為0.4—0.6時,加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L, 150 r/min誘導培養6h。取上述培養物于無菌試管中, 稀釋105后各取100 μL涂于LB(Kan+)平板。4℃分別處理0、1、2、3、4、5、6d后, 置于37℃繼續培養過夜并統計菌落數, 同時以BL21 [pET-28a(+)]菌株作為對照。每個處理均設置3個重復, 結果用統計軟件SPSS(17.0)進行分析, **表示與同期對照組相比差異極顯著(P<0.01), *表示與同期對照組相比差異顯著(0.01

2 結果

2.1 南極衣藻GST的定量表達

實時熒光定量PCR結果顯示, 在3個溫度GST均有表達(圖1), 且在對照溫度8℃時各個取樣時間GST的表達量相當; 0℃時, 第6h表達量低于初始水平, 第12h迅速恢復并繼續上升, 在處理36h時表達量達到最大, 為正常水平的兩倍多。其中在12h、24h時表達量顯著高于對照(P<0.05), 36h時表達量極顯著高于對照(P<0.01); 14℃時, GST的表達量均低于對照組, 且隨著時間的推移有一個緩慢下降的趨勢, 72h時的表達量約只有對照組的四分之一。

圖1 南極衣藻GST在不同溫度下的表達Fig. 1 The Real-time PCR analysis of the expression level of Chlamydomonas sp. ICE-L GST at different temperature

圖2 重組表達載體pET-28a(+)-GST的酶切鑒定Fig. 2 Restriction analysis of recombinant expression plasmid pET-28a(+)-GST

2.2 pE T-28a(+)-GST原核表達載體的構建

南極衣藻GST開放閱讀框PCR產物經測序證明GST-ORF擴增成功。重組表達載體(pET-28a (+)-GST)經BamH I、Sal I雙酶切, 呈現目的條帶和載體片段大小(圖2), 且測序結果共同證明重組表達載體構建成功。誘導表達實驗結果(圖3)顯示, pET-28a (+)-GST重組表達載體在18℃、28℃、37℃均能表達, 并在37℃誘導時表達量最大, 表達蛋白主要以包涵體形式存在;在最佳誘導溫度37℃時,目的蛋白的表達量受IPTG濃度影響較小, 但是無IPTG誘導目的蛋白不表達; 在一定時間內, 經相同IPTG濃度誘導目的蛋白的表達量隨時間的增加而增加, 在4h時達到最大。

圖3 重組表達載體pET-28a(+)-GST表達的優化Fig. 3 The optimization of pET-28a(+)-GST expression

2.3 pE T-28a(+)- GST表達蛋白的純化及Western blot鑒定

表達載體經0.2 mmol/L IPTG、37℃誘導4h獲得足量的表達產物, 經前期處理后采用HisTrap HP層析柱分離純化, SDS-PAGE電泳顯示得到的蛋白分子量約為26 kD(圖4B); Western blot檢測,在26 kD左右也有明顯條帶(圖4A),證明表達的蛋白為南極衣藻谷胱甘肽硫轉移酶蛋白。

圖4 pET-28a(+)-GST融合蛋白的SDSPAGE分析(B)和Western blot分析(A)Fig. 4 pET-28a(+)-GST purification product analysis of fusion protein by SDSPAGE (B) and Western blot analysis (A) M. protein marker 1, 2. GST expressed protein

2.4 重組菌BL21(pET-28a(+)-GST)的低溫耐受性分析

重組菌在LB板(Kan+)上經4℃處理不同時間后的生長結果(圖5)表明, 重組菌BL21(pET-28a(+)-GST)的存活率普遍高于對照菌BL21(pET-28a(+))。且在4天內, 重組菌的存活率顯著高于對照組(P<0.05), 說明重組菌的耐低溫能力得到增強; 而在第5、第6天時重組菌BL21(pET-28a(+)-GST)和對照菌BL21(pET-28a(+))存活率比較接近, 對低溫的耐受性沒有顯著性的差異(P>0.05)。

圖5 GST重組表達后宿主菌E. coli的耐低溫性分析Fig. 5 Protective effect of recombinant pET-28a(+)-GST on BL21 cell viability subjected to 4℃ treatment

3 討論

南極是地球上最冷的地區, 水溫常年在0℃左右, 低溫被認為是南極生物生存的一個最大挑戰。在低溫等環境中, 植物通常會產生一系列的氧化反應產生活性氧, 導致氧化脅迫, 對細胞造成很強的破壞性。GST作為生物體內的主要的抗氧化酶之一,可以催化谷胱甘肽與過氧化物質發生反應, 及時消除因嚴寒所產生的氧化脅迫, 將其轉化為無害或低毒物質, 從而協助保護生物體免受損害[18]。研究枸橘對低溫脅迫響應基因時, 發現4℃時的GST酶活性是25℃時的1.5倍[19]; 丁燏等[16]在蛋白水平上研究了溫度對南極衣藻中谷胱甘肽相關酶活性的影響,發現低溫(0℃、?10℃)時GST的活性明顯高于對照組; Sepp?nen, et al.[12]研究了生長于寒冷環境中野生馬鈴薯中GST基因的特性與表達發現, 該物種GST在寒冷環境中的表達量明顯增強, 說明寒冷能促進該物種GST基因的表達。本文根據南極衣藻在實驗室的最佳培養溫度為4—8℃, 應用實時熒光定量PCR檢測了南極衣藻經0℃與14℃處理后GST基因的表達情況(8℃為對照), 發現低溫時GST表達量最高, 最高時可達到對照組的2倍多、高溫組的5倍多(圖1), 在丁燏等[16]對南極衣藻經不同溫度處理后, 提取GST蛋白測其活性研究中發現: 低溫處理后GST酶活性較高, 最高可達到對照組的4倍; 說明低溫時GST酶的活性升高可能與GST的表達量的增加有關。從而本研究結果從基因表達水平進一步證實了丁燏等的研究結果, 證實低溫能誘導南極衣藻GST的表達以抵抗嚴寒環境所產生的氧化脅迫,從而幫助其有效地適應低溫環境。本文的結果也與其他植物的研究一致[12,19], 可見GST在生物適應低溫環境中具有普遍的作用。

為了進一步驗證南極衣藻適應南極嚴寒環境時GST所起的作用, 我們利用大腸桿菌表達體系具有培養周期短、成本低、高效表達和帶有His·tag易于純化等的優點[20], 構建了pET-28a(+)-GST表達載體(圖2)。由于IPTG濃度對pET-28a(+)-GST蛋白的誘導表達影響不明顯, 根據IPTG濃度過高會抑制細菌生長的原則, 確定重組質粒最佳表達條件: 0.2 mmol/L IPTG、37℃誘導4h。表達條件的優化為后續獲得大量GST蛋白以進行更深入的研究打下了基礎。

在南極衣藻GST的表達對E. coli BL21低溫耐受性增強實驗中, 由于表達產物主要以包涵體形式存在, 研究發現在原核表達產物中包涵體的形成主要是由于蛋白的表達量高、合成速度太快, 致使蛋白沒有足夠的時間進行正確的折疊, 過多的蛋白間的非特異性結合, 蛋白質無法達到足夠的溶解度所形成, 而低表達時很少形成包涵體[21]。為了讓目的蛋白GST在E. coli BL21內緩慢表達以減少包涵體的形成, 我們采取了降低轉速、延長誘導時間等措施。耐低溫實驗結果顯示, 在低溫條件下, 含有重組表達質粒的E. coli BL21的存活率在一定時間內比對照菌高, 說明南極衣藻GST在大腸桿菌E. coli BL21中的表達在一定時間內可以提高大腸桿菌的耐低溫能力。該結果與本研究熒光定量PCR結果及前人關于南極衣藻GST相關研究結果一致, 進一步驗證了南極衣藻GST基因的表達對其適應南極低溫環境起到了一定的積極作用。

近年來, 植物的抗逆性研究逐漸成為一個熱點,本研究結果證明了南極衣藻GST在其抗寒方面具有重要的作用, 這為了解南極衣藻對南極寒冷環境的適應提供了重要的理論依據, 也為植物抗逆基因工程應用中提供了重要的資料。

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INCREASED ESCHERICHIA COLI TOLERANCE TO LOW TEMPERATURE BY EXPRESSION OF GLUTATHIONE-S-TRANSFERASE GENE FROM THE CHLAMYDOMONAS SP. ICE-L

PENG Yue-Yue1,2, DING Yu1,2,3, WANG Jin-Hui1,2, JIAN Ji-Chang1,2,3, LU Yi-Shan1,2,3and LIU Ying1,2
(1. Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China; 2. Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals, Zhanjiang 524025, China; 3. Guangdong Key Laboratory of Control for Disease of Aquatic Economic Animals, Zhanjiang 524025, China)

Glutathione-S-transferase (GST, EC2.5.1.18) is the key antioxidant enzyme that catalyzes the conjugation of glutathione to several electrophilic substrates in living beings. Chlamydomonas sp. ICE-L is a rare ice algae living in the Antarctica where cold conditions and strong ultraviolet radiation are present all year round. In order to find out the role that GST in Chlamydomonas sp. ICE-L plays in acclimatizing to freezing polar environment, the expression of GST gene in Chlamydomonas sp. ICE-L was analyzed using real-time PCR under different temperatures. To evaluate the amount of template RNA in each real-time PCR reaction, gene fragments of β-actin was also amplified. The results showed that the Chlamydomonas sp. ICE-L GST gene could be expressed under all experimental temperatures. In the control group, as the temperature was 8℃, the accumulation of GST mRNA was maintained at identical level during 72h. At 0℃, GST mRNA accumulation decreased in the first 6h, which was followed by an increase and peaked at 36h (P<0.01) about more than twice of that in the control group, in the rest time the GST mRNA accumulation recovered to the level of control. At 14℃, the accumulation of GST mRNA was lower than the control group and slowly decreased during the entire experimental period and reached a quarter of the level in the control group at 72h. In addition, the pET-28a(+)-GST prokaryocyte expression vector was constructed and then transformed into E. coli BL21(DE3) to express the GST protein. The optimal expression conditions of pET-28a(+)-GST in E. coli BL21 included by 0.2 mmol/L concentration of IPTG, 37℃ and induction for 4h, and the product was mainly in the form of inclusion body. Using the HisTrap HP Columns, the expression product was separated and purified. Then the product was analyzed and confirmed by SDS-PAGE and Western blot, both results showed that the expression products with the molecular weight of 26 kD in the E. coli BL21(DE3) was the GST protein encoded by the GST gene from Chlamydomonas sp. ICE-L. At last, the E. coli BL21 containing the recombination plasmid (pET-28a(+)-GST) was treated with low temperature before growing on the agarose plate. As the recombination plasmid expressed mainly in the form of non-active aggregated monomers in E. coli BL21 induced with IPTG, we slowed the revolving speed and extended the induction time to express the GST protein with enzyme activation. The results of recombination plasmid treated with low temperature showed that the survival level of E. coli BL21 containing recombination plasmid (pET-28a(+)-GST) was higher than that of E. coli BL21 without this recombination plasmid in the first 4 days and reached the normal level at the 5thand 6thdays. Our results revealed that Chlamydomonas sp. ICE-L GST expressed in E. coli BL21 could improve the tolerance of E. coli to cold conditions, suggesting that GST may play an important role in the defense against freeze in the Chlamydomonas sp. ICE-L in Antarctica. These results provided valuable information on further investigation of the molecular mechanism of Chlamydomonas sp. ICE-L GST gene.

Chlamydomonas sp. ICE-L; Glutathione-S-transferase; Expression; Low temperature

Q786

A

1000-3207(2013)01-0016-06

10.7541/2013.16

2011-12-27;

2012-11-11

國家自然科學基金項目(40876102); 廣東省自然科學基金項目(S2011010005885)資助

彭躍躍(1985—), 男, 湖南人; 碩士研究生; 研究方向為海洋微生物學與病害防治。E-mail: pengyueyue8579@163.com

丁燏(1971—), 博士, 教授; 主要研究方向為海洋微生物學與病害防治。E-mail: dingy@gdou.edu.cn