異育銀鯽體內鹽酸雙氟沙星血漿蛋白結合率的變化與其藥代動力學研究

章海鑫胡 鯤阮記明鄭衛東符貴紅楊先樂王會聰劉 攀

(1.上海海洋大學國家水生動物病原庫, 上海 201306; 2. 江西省水產科學研究所, 江西 南昌 330039; 3. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 武漢 430223; 4. 中國水產科學研究院東海水產研究所農業部,海洋魚河口漁業資源及生態重點開發實驗室, 上海 200090)

異育銀鯽體內鹽酸雙氟沙星血漿蛋白結合率的變化與其藥代動力學研究

章海鑫1,2*胡 鯤1阮記明1鄭衛東3符貴紅4楊先樂1王會聰1劉 攀1

(1.上海海洋大學國家水生動物病原庫, 上海 201306; 2. 江西省水產科學研究所, 江西 南昌 330039; 3. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 武漢 430223; 4. 中國水產科學研究院東海水產研究所農業部,海洋魚河口漁業資源及生態重點開發實驗室, 上海 200090)

為了研究鹽酸雙氟沙星(Difloxacin, DIF)在異育銀鯽體內血漿蛋白結合率的變化及其與藥代動力學之間的關系, 實驗采用超濾法測定了DIF在異育銀鯽體內血漿蛋白結合率, 運用HPLC測定其對應時間點藥物濃度, 并分析了血漿蛋白結合率變化對DIF體內處置的影響。實驗以感染嗜水氣單胞菌的異育銀鯽為感染組, 健康異育銀鯽為對照組。結果顯示: 感染組各時間點DIF血漿蛋白結合率均高于對照組, 感染組與對照組DIF血漿蛋白結合率與總藥物濃度呈對數關系: y=?9.01ln x+74.34和y=?4.81ln x+65.15, DIF血漿蛋白結合率與游離藥物濃度的對數關系式分別為: y =?6.36ln x + 64.91和y = ?4.36ln x+ 60.63; 感染組和對照組血漿藥時曲線均可使用開放性二室模型描述; 感染組DIF的吸收和消除慢于對照組, 其表觀分布容積和曲線下面積大于對照組。結果顯示異育銀鯽體內感染嗜水氣單胞菌促使DIF血漿蛋白結合率升高; 血漿蛋白結合率升高導致藥物以結合藥物的形式儲存于血液中可能是導致藥物組織分布受限、消除緩慢、長時間滯留于血液原因之一。

鹽酸雙氟沙星; 異育銀鯽; 嗜水氣單胞菌; 血漿蛋白結合率; 藥代動力學

動物感染病菌后機體生理功能的改變影響著治療藥物的血漿蛋白結合率, 血漿蛋白結合率的增高或降低勢必制約藥物的體內游離濃度, 從而進一步影響藥物在動物體內的分布、代謝和消除規律[1,2]。血漿蛋白結合率越高, 游離藥物濃度越低, 藥物的生物利用度也越低[3,4]。在臨床藥動學研究中, 藥物在患病動物體內的血漿蛋白結合率的變化也相應的對其代謝動力學產生影響。然而, 目前大多水產藥代動力學是以健康養殖動物為研究對象, 均未考慮患病水產動物生理變化及血漿蛋白結合對藥代動力學的影響[5—8], 其研究結果不能完全反應患病水產動物體內實際代謝狀況, 也未研究血漿蛋白結合率對藥物體內過程的影響[9,10]。雖然有些研究中測定了血漿蛋白結合率, 但均未分析其與藥物體內處置過程的關系[11—13]。因此, 比較感染組與對照組水產動物體內藥物血漿蛋白結合率的變化情況和藥代動力學的差異, 分析血漿蛋白結合率對于藥物體內處置過程的影響, 對于規范、合理地使用水產藥物及有效地控制藥物殘留具有極其重要的實踐意義。

本文以鹽酸雙氟沙星(Difloxacin, DIF)[14]為研究對象, 比較了DIF在感染嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)與健康異育銀鯽(Carassais auratus gibebio)體內血漿蛋白結合率和藥代動力學差異, 分析了在不同生理條件下藥物血漿蛋白結合率對于藥物體內處置的影響。從而填補了DIF水產動物藥代動力學中的血漿蛋白結合的空白, 并為臨床使用DIF治療嗜水氣單胞菌感染提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

雙氟沙星(DIF)標準品(含量≥99.9%)、購于Sigma公司; 鹽酸雙氟沙星原料藥(純度為98%)由浙江國邦藥業有限公司提供。乙腈、四丁基溴化銨均為HPLC級; 二氯甲烷、正己烷、檸檬酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、高氯酸均為分析純, 以上藥品均由國藥集團化學有限公司提供。

1.2 儀器與設備

Agilent-1100型高效液相色譜儀(配熒光檢測器); 漩渦混合器; 氮氣吹干儀; METTLER AB104-N型精密電子天平; Allegrax-15R型高速冷凍離心機,超濾管(Amicon 10kD)。

1.3 試驗動物

健康的異育銀鯽購買于江蘇省南通某國營農場,體重為(40±5) g, 使用自動控溫充氣系統控制水溫為(25±1)℃, 供氧充足; 每兩天換水1次, 并及時清除水體殘餌和排泄物。暫養一月后選取200尾試驗, 20尾做空白對照。90尾異育銀鯽感染嗜水氣單胞菌(感染組), 90尾正常藥物代謝試驗(對照組)。

1.4 嗜水氣單胞菌感染

嗜水氣單胞菌(BYK-080916)由上海海洋大學國家水生動物病原庫提供, 試驗前腹腔注射健康異育銀鯽復壯, 菌株制成菌懸液。按0.2 mL/尾注射含菌量為107cells/mL的菌液時, 異育銀鯽沒有出血癥狀;注射109cells /mL的菌液12h, 異育銀鯽死亡率達到50%, 24h達到90%; 注射108cells/mL的菌液12h后, 魚體出現有細菌性敗血癥的的癥狀。如體表出血、眼球突出、腹部膨大、腹鰭和胸鰭充血; 腹腔內充紅腹水, 內臟充血, 肛突, 腹膜及鰾出血、腸壁發紅, 內有黃色黏液, 選擇此類活力均等的異育銀鯽進行試驗。

1.5 給藥與取樣

按20 mg/kg魚體重標準用細導管灌鹽酸DIF口服液入感染組和對照組魚的前腸, 無回吐的留作實驗。分別在給藥后0.017、0.25、0.5、1、3、6、12、24、48、72、96、120、168和210h尾靜脈采血0.5 mL/尾, 同一時間點采5尾。加入等體積ACD抗凝(n=5); 在4℃條件下3000 r/min離心10min, 分離血漿放入?70℃冷凍保藏至樣品處理。

1.6 血漿樣品處理

血漿總藥物濃度 取1 mL血漿加入酸化乙腈(乙腈∶鹽酸∶水=250∶1∶1) 5 mL, 漩渦混合10 min, 4℃條件下8000 r/min離心10min, 取上清液, 45℃恒溫氮氣條件下吹干, 加1 mL流動相溶解, 經0.45 μm微孔濾膜過濾, HPLC測定。

游離藥物濃度與結合率 血漿游離藥物濃度: 取0.5 mL血漿加入超濾管(10 KD), 4℃條件下14350 r/min離心120min, 收集超濾液。超濾液中加入5 mL二氯甲烷, 漩渦混合10min, 4℃條件下8000 r/min離心10min。取有機相, 45℃恒溫氮氣條件下吹干。1 mL流動相溶解殘留物, 0.45 μm微孔濾膜過濾后HPLC分析。

藥物結合率=(總藥物濃度?游離藥物濃度)/總藥物濃度×100%

1.7 藥物檢測

血漿總藥物濃度與游離藥物濃度采用高效液相色譜法(HPLC)進行檢測, 色譜條件采用李海迪等[15]的方法。血漿標準曲線為y=16.49x 1.57, R2=0.999,超濾液標準曲線為y=29.10x4.78, R2=0.999。DIF在血漿和超濾液中的絕對回收率均大于92.5%和95.0%, 日內精密度RSD(n=5)均小于0.99%和0.48%,日間精密度RSD(n=5)均小于0.84%和0.90%。

1.8 統計方法

圖表制作使用Office 2007軟件進行; 數據處理、方差分析采用SPSS 13.0軟件進行; 藥代動力學參數使用DAS 3.0軟件進行計算。

2 結果

2.1 感染組與對照組總藥時曲線和游離藥時曲線

感染組和對照組總藥時曲線(圖1), 圖中可見感染組前1h藥物濃度均很低, 6h才達到峰值, Cmax為6.39 μg/mL; 1—6h時間段藥物濃度穩定, 未出現重吸收峰。210h時血漿中藥物濃度降到所有測定樣品的最低值。對照組對于藥物的吸收明顯快于感染組,對照組血漿鹽酸雙氟沙星達峰時間Tmax為0.25h; 達峰濃度Cmax為15.06 μg/mL, 3h出現重吸收峰; 之后快速下降; 6h前藥物濃度高于感染組, 之后藥物濃度低于感染組。210h時已檢測不出藥物。結果表明感染組對于DIF的吸收、排泄滯后于對照組。

圖2為感染組總藥時曲線與游離藥時曲線, 由圖可知感染組的游離藥時曲線與總藥時曲線達峰時間Tmax均為6h, 達峰濃度Cmax分別為2.53和6.39 μg/mL, 且均在1—6h有一段濃度平緩期, 之后緩慢消除; 總藥物濃度與游離藥物濃度變化不平行。圖3為對照組總藥時曲線與游離藥時曲線, 對照組游離藥時曲線與總藥時曲線達峰時間Tmax均為0.25h, 達峰濃度Cmax分別為7.04和15.07 μg/mL; 3h也出現重吸收峰, 之后緩慢消除, 總藥物濃度與游離藥物濃度變化不平行。

圖1 感染組與對照組異育銀鯽血漿中DIF藥時曲線(n=5, Mean±SD)Fig. 1 Concentration time curve of difloxacin in plasma of the infected and healthy Carassais auratus gibebio(n=5, Mean±SD)

圖2 感染組異育銀鯽血漿中DIF游離與總藥時曲線(n=5, Mean±SD)Fig. 2 Concentration time curve of free and total difloxacin in plasma of infected Carassais auratus gibebio(n=5, Mean±SD)

圖3 對照組異育銀鯽血漿中DIF游離與總藥時曲線(n=5, Mean±SD)Fig. 3 Concentration time curve of free and total difloxacin in plasma of control group Carassais auratus gibebio(n=5, Mean±SD)

2.2 感染組與對照組總藥物與游離藥物藥代動力學

感染組與對照組異育銀鯽口服DIF后, 藥時數據使用DAS 3.0軟件進行動力學模型擬合和參數計算, 主要參數(表1)。結果顯示: 感染組與對照組總藥時數據均可使用開放性二室模型描述, 游離藥時數據也能使用開放二室模型進行擬合。感染組體內DIF的T1/2α、AUC、Vd、T1/2β均大于對照組, 分別為6.34和2.09 h、303.65和229.13 μg?h/mL、2.59和0.87 /kg、107.92和71.75h; CL、Ka則均小于對照組,分別為0.07和0.09/(h?kg)、2.75和0.41 /h。感染組游離DIF的CL、Ka均大于對照組, 分別為0.28和0.19/(h?kg)、3.35和0.39 /h; AUC、Vd均小于對照組,分別為72.41和106.46 μg?h/mL、1.35和1.58 /kg。

表1 感染組與對照組異育銀鯽單次口灌DIF后血漿藥物動力學參數Tab. 1 The pharmacokinetic parameters of difloxacin in plasma of control group and infected Carassais auratus gibebio

2.3 血漿蛋白結合率與總藥物濃度及游離游離藥物濃度

藥物血漿蛋白結合率與游離藥時曲線的關系(圖4)。圖中可以看到感染組與對照組異育銀鯽血漿蛋白結合率均不穩定, 感染組藥物血漿蛋白結合率在各時間點均高于對照組, 且均會隨著時間的變化而變化。感染組1h前游離藥物濃度緩慢上升, 結合率緩慢下降, 1—6h保持較高的游離藥物濃度時, 結合率保持穩定; 之后游離藥物濃度降低而結合率升高。對照組在0.25h和3h兩個吸收峰時結合率最低,游離藥物濃度降低時結合率也升高。

對結合率與總藥物濃度和游離藥物的關系分析結果(圖5), 由圖可知血漿蛋白結合率的變化和藥物濃度有一定的關系。感染組與對照組的血漿蛋白結合率隨著總藥物濃度的升高而降低, 并趨向于平穩。這表明DIF與異育銀鯽血漿蛋白的結合率與藥物濃度有關。濃度高, 結合率下降, 結合部位趨于飽和,游離藥物濃度升高。分析結合率和總藥物濃度的關系,發現存在一定的對數關系, 感染組: y=?9.01ln x+ 74.34, R2=0.927, 對照組: y=?4.81ln x+65.15, R2= 0.857。感染組與對照組血漿蛋白結合率與游離藥物濃度也存在一個相互變化的過程, 也呈現出對數關系, 感染組: y = ?6.36ln x + 64.91, R2= 0.983 ; 對照組: y = ?4.36ln x+ 60.63, R2= 0.889。

圖4 感染組與對照組異育銀鯽血漿中游離DIF濃度與結合率(n=5, Mean±SD)Fig. 4 The free difloxacin concentration inplasma and protein binding rate in control group and infected Carassais auratus gibebio(n=5, Mean±SD)

3 討論

3.1 血漿蛋白結合率與總藥物濃度和游離藥物濃度關系

圖5 DIF血漿蛋白結合率與血漿藥物濃度Fig. 5 The difloxacin protein binding rate and drug concentration in plasma

藥物的藥理作用取決于未結合的游離藥物在作用部位的濃度和持續時間, 因此, 血液中游離藥物濃度具有更大的臨床意義。對于飽和結合的藥物,雖然不能通過測定血藥總濃度直接測量作用部位的游離藥物濃度, 但可以用總藥物濃度乘以藥物的游離率獲得藥物的游離藥物濃度[16,17], 藥物的游離率由藥物與血漿蛋白的親和力以及結合蛋白位點數決定[18]。然而有些藥物蛋白結合率具有濃度依賴性,結合率會隨著藥物濃度而變化, 血漿藥物蛋白結合率的差異影響藥物臨床效果[19—21]。此外, 藥物血漿蛋白結合率大于90%為高蛋白結合率, 小于20%為低蛋白結合率[22]。在實驗中感染組與對照組的藥物血漿蛋白結合率均在90%和20%之間, 屬于中度結合, 結合率與總藥物濃度和游離藥物濃度之間具有一定的相關性, 因此監測藥物的游離濃度具有較大的臨床意義。在實驗中感染組與對照組的藥物血漿蛋白結合率隨著總藥物濃度和游離藥物濃度的升降分別降低和升高, 而且與總藥物濃度和游離藥物濃度成一定的對數關系; Steven M, et al.[23]同樣發現氟甲喹在斑點叉尾?體內的血漿蛋白結合率隨著藥物濃度的升高而降低; 余建鑫等[24]和Ismail[25]在各自的研究中發現血啉甲醚血漿蛋白結合率和DIF駱駝血漿蛋白結合率均隨著藥物濃度升高而降低。這表明DIF與異育銀鯽血漿蛋白的結合率與藥物濃度有關。濃度高, 結合率下降, 結合部位趨于飽和, 游離藥物濃度升高。

藥物血漿蛋白結合率由藥物理化性質和動物生理決定, 在不同生理條件下藥物血漿蛋白結合率不一樣[22], 在實驗中感染組DIF血漿蛋白結合率在各個時間點均明顯地高于對照組。Uno[11]同樣發現土霉素在健康香魚體內血漿蛋白結合率低于感染弧菌香魚體內的結合率, 許敏[12]發現肝損傷小鼠體內芍藥苷和芍藥內酯的血漿蛋白結合率大于健康小鼠體內。對于感染組藥物血漿蛋白結合率高于對照組的原因目前還不是很清楚, 但Curt認為電解質和體液失調會影響藥物的分布容積, 改變藥物的蛋白結合[26]; 同樣有文獻報道感染嗜水氣單胞菌后水產動物體內總蛋白和球蛋白含量增加, 白蛋白無顯著變化, 電解質和體液失調[21,22,27]; 但其是否與藥物血漿蛋白結合率的變化有關還有待進一步的確定。

綜上所述表明DIF血漿蛋白結合具有一定的藥物濃度依賴性, 能夠影響體內藥物的總濃度和游離濃度。此外, 感染嗜水氣單胞菌引起異育銀鯽生理變化而導致DIF血漿蛋白結合率的變化, 具體機制還不是很清楚。

3.2 感染嗜水氣單胞菌對異育銀鯽體內DIF藥代動力學的影響

DIF的藥時曲線受到動物生理、給藥方式及溫度等的影響, Ding F K, et al.[28]發現 DIF在鯽體內的代謝房室模型與溫度有關, 李海迪等[15]、丁煥中等[29]發現 DIF房室代謝模型為二室模型。在實驗中DIF在感染組和對照組體內藥時曲線合游離藥時曲線均能使用開放的二室模型進行擬合, 但其藥代參數具有較大的差異; 同樣有達氟沙星和芍藥苷在感染模型和健康模型體內的代謝房室模型沒有發生改變的報道[8,12]。

患病動物機體的生理變化影響著藥物的體內處置過程[30], 當急性或慢性疾病影響肝臟時, 均可明顯影響某些藥物在肝臟中的代謝, 藥代動力學特征表現為藥物清除率降低, 半衰期延長。在實驗中對照組對于DIF的吸收快于感染組, 且達峰濃度大于感染組; 但消除半衰期明顯長于對照組, 藥時曲線下面積也大于對照組; 表觀分布容積大于對照組。文獻報道感染嗜水氣單胞菌的魚肝腎功能會發生相應的變化, 導致肝腎功能下降和紊亂[31,32]。感染嗜水氣單胞菌后腎小球的濾過與重吸收功能失調, 腎小球過濾受損或減退容易使體液和血液中過多的含氮物質在體內積蓄, 而使藥物消除減慢、 半衰期延長[33]。劉彥等比較感染鰻弧菌牙鲆與健康牙鲆藥物代謝動力學時發現感染鰻弧菌的牙鲆對于達氟沙星的吸收慢于健康的牙鲆, 曲線下面積大于健康魚,而消除半衰期延長[8]; 應翔宇在研究恩諾沙星在健康及巴氏桿菌感染雞體內的藥物代謝動力學時也得到類似的結果[34]。這表明DIF在感染嗜組與對照組間的藥代動力學差異是由于感染嗜水氣單胞菌引起的起肝腎等功能的變化而產生。Uno 也認為細菌感染影響機體的正常功能導致機體對藥物的吸收能力下降[11]。綜上所述, 嗜水氣單胞菌感染沒有改變DIF體內分布的房室模型, 但能夠顯著的降低DIF的體內吸收速率和達峰時間, 延長其體內消除。

3.3 DIF血漿蛋白結合率對其體內處置的影響

在實驗中感染組總藥物和游離藥物濃度前6h均低于對照組, 但血漿蛋白結合率高于對照組, 感染組藥時曲線下面積、表觀分布容積均大于對照組,消除半衰期長于對照組; 但感染組游離藥物藥時曲線下面積、表觀分布容積均小于對照組, 消除半衰期短于對照組。藥物血漿蛋白結合率的高低直接影響藥物體內的分布和處置[18], 表觀分布容積為藥物在動物體內分布的廣窄的參數, 由血漿分布容積和組織分布容積組成, 分布容積與組織結合成正相關、與血漿蛋白結合成反相關, 即血漿蛋白結合率低導致血管外分布增大[35,36]。血漿蛋白結合影響藥物的游離分布容積和組織分布容積, 結合率的升高降低藥物游離分布容積, 使得藥物組織分布受限而血漿分布容積升高[18]; 結合率低的藥物易通過血腦屏障, 結合率高的藥物則不易通過血腦屏障, 如磺胺噻唑與血漿蛋白結合率高, 很難進入到腦脊液;磺胺甲嘧啶與血漿蛋白結合率低, 則進入腦脊液的藥物較多[22]。此外, 影響藥物從腎小球濾過的主要因素是藥物與血漿蛋白的結合程度以及腎小球的濾過率[22], 當腎臟發生疾病時對于某些幾乎完全從腎臟排泄的藥物, 比如氨基糖苷類, 在動物體內容易積蓄, 甚至由于積蓄產生毒性[26]。綜上所述, 由于嗜水氣單胞菌感染, 導致異育銀鯽對于DIF的吸收受限而使得6h前的血漿藥物濃度均低于對照組; 感染組藥物血漿蛋白結合率高于對照組, 導致藥物體內組織分布受限和降低腎臟對于藥物的排泄能力; DIF在感染組體內停留的時間更長, 以結合藥物形式大量儲存于血液中, 阻礙了藥物的體內分布。Uno[37]認為土霉素在南美白對蝦體內具有較大的組織分布容積是由于土霉素與南美白對蝦血液淋巴具有較小的結合率, Uno[13]噁

也認為喹酸在竹節蝦體內的血漿分布容積大于土霉素是由于噁喹酸血漿蛋白結合率大于土霉素; 白芍藥總苷中芍藥苷和芍藥內酯在急性CCL4肝損傷大鼠內的血漿蛋白結合率大于健康白鼠, 其半衰期也相應地延長[12]。

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RESEARCHES OF PLASMA PROTEIN BINDING RATE OF DIFLOXACIN AND ITS PHARMACOKINETIC IN CARASSAIS AURATUS GIBEBIO

ZHANG Hai-Xin1,2, HU Kun1, RUAN Ji-Ming1, ZHENG Wei-Dong3, FU Gui-Hong4, YANG Xian-Le1, WANG Hui-Cong1and LIU Pan1
(1. National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals, Shanghai 201306, China; 2. Jiangxi Fisheries Research Institute, Nanchang 330039, China; 3. Yangtze River Fisheries Research, Institute Chinese Academy of Fishery Scientific, Wuhan 430223, China; 4. Key and Open Laboratory of Marine and Estuarine Fisheries, Ministry of Agriculture, East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Shanghai 200090, China)

To investigate the relationship between the diversities of plasma protein binding rate of Difloxacin (DIF) and its pharmacokinetic in Carassais auratus gibebio, ultrafilteration and high performance liquid chromatographic (HPLC) methods were applied to determine the plasma protein binding rate and pharmacokinetics of DIF in both infected by Aerominas hydrophila bacteria (infected group) and healthy Carassais auratus gibebio (healthy group), and the relationships between the diversities of plasma protein binding rate of DIF and its pharmacokinetic were analyzed in this paper. The results showed that the plasma protein binding rates of the drug in infected group was significantly higher than that of the healthy group at the corresponding time points. The plasma protein binding rates had logarithmic relationships with the total drug concentration and their equations were y=?9.01ln x+74.34(Infected group)and y=?4.81ln x+65.15(Healthy group), while the equations between the plasma protein binding rates and free concentration of the drug were y = ?6.36ln x + 64.91(Infected group) and y = ?4.36ln x+ 60.63(Healthy group) in these two groups. Meanwhile the concentration time curve of the two groups were all in accordance with the two-compartment open model. The absorptions and eliminations of DIF in infection group were slower while its apparent distribution volumes and the area under the concentration-time curves were greater than that of the healthy group. The results indicate that the values of the plasma protein binding rates of DIF could be increased by Aeromonas hydrophila in crucian carp, and this may be one of the reasons that leads to limit distribution of drugs, elimination of slowing down and a long stay in the blood in crucian carp which infected by Aeromonas hydrophila.

Difloxacin; Carassais auratus gibebio; Aerominas hydrophila; Plasma protein binding rate; Pharmacokinetic

S948

A

1000-3207(2013)01-0062-08

10.7541/2013.62

2011-12-04;

2012-11-01

國家863計劃項目(2011AA10A216); 國家自然科學基金(31172430); 農業部行業專項(200803013)資助

章海鑫(1985—), 男, 江西宜春人; 碩士; 主要從事水產病害和藥理學研究。E-mail: zhang73860@126.com *并列第一單位

楊先樂(1949—), 男, 教授, 博士生導師; E-mail: xlyang@shfu.edu.cn