大葉藻居群微衛星遺傳多樣性研究

孫典榮李 淵李文濤高天翔

(1. 中國水產科學研究院南海水產研究所, 廣州 510300; 2. 中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003)

大葉藻居群微衛星遺傳多樣性研究

孫典榮1李 淵2李文濤2高天翔2

(1. 中國水產科學研究院南海水產研究所, 廣州 510300; 2. 中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003)

采用4對微衛星引物對大葉藻的7個地理居群進行了遺傳多樣性與遺傳結構分析。擴增148株大葉藻得到57個等位基因, 每個位點平均等位基因數為6, 大葉藻居群的平均期望雜合度(He)為0.687, 平均觀測雜合度(Ho)為0.417。青島灣居群的遺傳多樣性最高(A=7.750, AR=7.043), 俚島居群最低(A=4.750, AR=4.543)。從Fst值來看, 7個大葉藻居群間屬于中度分化。UPGMA系統發育樹顯示, 中國4個大葉藻居群聚類到一起,其遺傳分化可能是由于歷史大海草場的遺留小片段居群產生, 而中國、韓國、日本和愛爾蘭居群間的遺傳分化則主要是由于地理隔離造成的。自由交配估計結果支持海草的東亞起源說。青島灣居群遺傳多樣性較高,可優先作為大葉藻移植修復的材料和基因庫, 并進行重點保護。

大葉藻; 居群; 微衛星; 遺傳多樣性; 遺傳結構

大葉藻(Zostera marina L.)是北半球廣泛分布的一種海草, 能生長在亞熱帶到冷溫帶, 甚至是亞寒帶的沿岸淺水區[1]。大葉藻可為一些重要的經濟魚類、貝類、棘皮動物等提供直接的食物來源、棲息場所、隱蔽場所和育幼場, 還能緩沖洋流和潮汐對海底基質的擾動, 并且從洋流中過濾懸濁物和營養物質, 其根和根狀莖生長在沉淀物中, 具有穩定海底沉積物的作用, 從而改善海水的透明度[2,3]。由于大葉藻對水質的敏感性, 因此可以作為沿海水域環境的指示劑。1930年, 世界范圍的大葉藻海草場經歷了“枯萎病”, 導致大葉藻幾近滅絕, 而如今世界范圍內的大葉藻海草床嚴重退化[4,5], 許多地方的大葉藻居群正承受著環境和基因的雙重壓力, 出現了一些頂梢枯死的現象[5], 我國的大葉藻海草床亦未能幸免[6]。

隨著分子生物學技術的應用, 關于大葉藻的遺傳學分析有了更為深入的研究[7]。同工酶研究結果顯示, 大葉藻居群等位酶變異較少, 并不能提供足夠的信息量, 不能清楚地反映大葉藻居群遺傳分化、遺傳結構與其生殖策略和空間分布的關系[5,8,9]。因此, 大葉藻居群的遺傳結構有待于應用多態性和靈敏度更高的分子標記進行探討。微衛星(SSR)標記具有多態性高、突變快、雜合度高、共顯性等特點,已被廣泛應用于海洋生物遺傳多樣性研究[10]。迄今,國外學者利用SSR標記開展了一些大葉藻居群遺傳學研究。Reusch[11]利用SSR技術對瓦倫登海和波羅的海兩個海域的大葉藻進行相關性研究, 發現瓦倫登海海域大葉藻的有效種群較大, 且居群間基因交流較頻繁; Olsen, et al.[3]對北半球49個大葉藻居群進行了SSR研究, 探討了大葉藻的歷史傳播途徑,并發現北歐海域的大葉藻遺傳多樣性較高; Campanella, et al.[5]利用SSR標記技術對新澤西巴尼加特灣8個大葉藻居群進行了遺傳學研究, 并以此判斷適合作為移植修復的居群; Oetjen, et al.[12]開發了15對大葉藻SSR引物, 并結合SNP分子標記對瓦倫登海域大葉藻居群的特定生境選擇進行了研究。目前, 國內尚未見到對海草尤其是大葉藻居群遺傳學研究的相關報道。本研究采用4對SSR引物, 對7個不同地理居群的大葉藻遺傳多樣性進行了研究,研究結果不僅可為我國大葉藻資源現狀的評價、管理和移植修復提供遺傳背景資料和科學依據, 同時也將充實海草保護遺傳學資料, 對于有類似分布和生物學特性的其他海草類群也具有重要的借鑒和參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用大葉藻樣品分別采自中國的威海俚島、威海天鵝湖、青島灣、大連近海以及日本東京灣、韓國內浦和愛爾蘭克萊爾郡近海(圖1)。樣品采集后用海水洗凈, 取新鮮葉片放入裝有硅膠的離心管中, 或將新鮮樣品浸于海水直接帶回實驗室。采樣時, 為確保所采樣品為不同植株, 植株間隔至少在2 m以上。每個地點隨機采取24株植株, 7個居群共168株大葉藻樣品。

1.2 實驗方法

基因組DNA提取 取適量大葉藻新鮮葉片或干燥葉片, 參照Ban[13]的CTAB(Cetyltrimenthylammonium bromide)法并加以改良來提取基因組DNA,將乙醇沉淀后的基因組DNA溶解于100 μL蒸餾水中, 4℃保存備用。取提取的DNA 3 μL用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 以備之后的PCR擴增。

微衛星分析 在前期實驗的基礎上, 本研究選用了4對多態性較高的微衛星引物[14,15], DNA擴增按照各引物的PCR反應條件和程序進行。PCR反應體積為10 μL, 各反應均設陰性對照以檢查是否有DNA污染。取1.5 μL擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并以核酸分子量標準Marker作對照, 在紫外透射分析儀上檢測所需的目的條帶, 8%變性聚丙烯酰胺凝膠膠上電泳分型、銀染和顯影。

1.3 數據分析

使用POPGENE軟件計算等位基因數(A)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)。使用GENEPOP軟件進行Hardy-Weinberg平衡檢驗與連鎖不平衡檢驗。所有多重檢驗的顯著性標準用連續Bonferroni法進行校正。根據Bostein, et al.[16]方法和等位基因豐富度(Allelic richness, AR), 應用MS tools工具計算獲得多態信息含量PIC(Polymorphism Information Content)。用MICRO-Checker軟件評估每個位點的無效等位基因。

利用軟件FSTAT對兩兩群體間的遺傳分化指數Fst進行量化分析, 并對其進行顯著性多重檢驗。利用MEGA 4.1構建UPGMA系統樹, 重復計算10000次獲得各分支的支持率。運用STRUCTURE軟件推導最可能自由交配群。

2 結果

圖1 大葉藻采樣地點Fig. 1 Sampling sties of Z. marina

2.1 居群遺傳多樣性

對大葉藻居群的微衛星分析結果表明, 148株大葉藻個體檢測到57個等位基因, 7個居群的大葉藻在4個微衛星位點上等位基因數為2—14, 每個位點平均等位基因數為6, 多態性適中(表1)。平均觀測雜合度為0.417, 平均期望雜合度0.687。各位點觀測雜合度(Ho)在0.330(CT-3)—0.517(CT-17H)變化, 各居群的Ho范圍在0.283(天鵝湖居群)—0.538 (愛爾蘭克萊爾郡居群); 各位點期望雜合度(He)為0.528 (CT-35)—0.8131(CT-17H), 各居群的He范圍為0.240(天鵝湖居群)—0.910(愛爾蘭克萊爾郡居群)。Fis值范圍在?0.135(CT-35)—0.823(CT-17H)。等位基因豐富度(AR)在各居群的范圍為4.543—7.043, 俚島居群最低, 最高值出現在青島灣居群, 平均AR值為5.727。以青島灣居群的遺傳多樣性最高(A=7.750, AR=7.043), 俚島居群最低(A=4.750, AR=4.543)。

根據各位點等位基因在7個大葉藻居群中的分布頻率(數據未顯示), 發現CT-35位點等位基因CT-35-3和CT-35-7—13與群體具有顯著的相關性(列聯表檢驗P<0.01)。CT-35-3在北太平洋區域的6個居群(中國、韓國和日本居群)相對其他等位基因具有較高頻率(31.251%—86.362%), 而CT-35-9—13只在北大西洋區域的愛爾蘭居群中存在, CT-35-7—8同樣在愛爾蘭居群中具有較高頻率(圖2)。

表1 大葉藻7個居群4個微衛星位點的遺傳多樣性指標Tab. 1 Genetic diversity indices for four microsatellite loci in seven populations of Z. marina

2.2 遺傳結構分析

圖2 CT-35等位基因在7個大葉藻居群中的頻率分布圖Fig. 2 Frequency distribution of allele CT-35 in seven populations of Z. marina

表2 大葉藻兩兩群體間FstTab. 2 Pairwise Fstamong populations of Z. marina

結果顯示, 大葉藻7個地理居群間存在明顯的遺傳分化(表2)。從Fst數值來看, 青島與大連居群間最小, 為0.051; 最大值為0.261, 出現在天鵝湖與愛爾蘭克萊爾郡居群之間; 國內居群Fst最大值出現在天鵝湖和大連居群間, 為0.189; 國內居群與國外居群Fst最小值出現在大連和韓國內浦居群間, 為0.110。從Fst顯著性來看, 極顯著值(P<0.01)出現在俚島與天鵝湖、韓國內浦、日本東京灣、愛爾蘭克萊爾郡居群間, 天鵝湖與青島灣、日本東京灣、愛爾蘭克萊爾郡居群間, 青島灣與大連、韓國內浦、愛爾蘭克萊爾郡居群間, 大連與韓國內浦、愛爾蘭克萊爾郡居群間, 韓國內浦與日本東京灣居群間。俚島與青島灣、大連居群間, 青島灣與日本東京灣居群間, 韓國內浦與愛爾蘭克萊爾郡居群間差異顯著(P<0.05)。

利用MEGA 4.1構建的UPGMA系統樹顯示:青島和大連兩居群先聚類, 然后與俚島和天鵝湖居群聚類; 國內大葉藻居群與韓國內浦大葉藻聚類后,再與日本東京灣居群聚到一起, 最后與北大西洋區的愛爾蘭居群聚類(圖3)。

圖3 基于7居群大葉藻間遺傳距離構建的UPGMA樹Fig. 3 UPGMA tree based on genetic distance of seven Z. marina populations

2.3 自由交配估計

運用STRUCTURE軟件, 根據等位基因頻率不相關假設(Allele frequencies independent assumption)[17], 總樣本的預測自由交配組數為K=2(圖4)。基于微衛星分子標記的個體分配模式顯示, 國內4個大葉藻居群(俚島、青島灣、大連和天鵝湖)的絕大部分(87%以上)被分配在二號自由交配群(圖4,灰色部分; 表3), 尤其是俚島居群, 96.8%被分配到二號自由交配群; 國外3個大葉藻居群(韓國內浦、日本東京灣和愛爾蘭克萊爾郡)的絕大部分(76%以上)被分配在一號自由交配群(圖4, 黑色部分; 表3),尤其是愛爾蘭克萊爾郡居群, 幾乎全部(98.6%)被分配于一號自由交配群。

3 討論

物種的遺傳多樣性是長期進化的產物, 是其生存適應和發展進化的前提[18]。物種遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富, 對環境變化的適應能力就越強[19];反之, 具有較低遺傳多樣性的物種則更容易受到環境變化的影響。因此, 通過遺傳多樣性研究, 除了可以了解物種的進化歷史, 也可以為分析物種的進化潛力和預測物種發展方向提供重要依據。

本研究基于微衛星分子標記對中國、韓國、日本和愛爾蘭7個居群的大葉藻遺傳多樣性進行了分析, 由于所承受的環境壓力不同(如: 海流、溫度、底質、光照、其他藻類的繁殖競爭等), 各居群表現出不同的遺傳多樣性及不同的遺傳結構。研究結果顯示, 7個大葉藻居群觀測雜合度(0.283—0.538)明顯低于期望雜合度(0.621—0.793), 表明7個大葉藻居群間交流很少, 自交或者無性生殖過多。對于大葉藻而言, 這種現象較為常見。Campanella, et al.[5,20]在對新西蘭巴尼加特灣和西大西洋沿海的大葉藻居群研究中也得到相同的結果; 而Reusch, et al.[15]則得到觀測雜合度與期望雜合度相差不大的結果。等位基因豐富度高意味著適應能力更強, 與其他居群交流頻繁[20]。7個大葉藻居群的平均等位基因豐富度為5.727, 低于西大西洋沿海(6.3)[20], 而高于加拿大海域(4)[3]居群。多態信息含量(PIC)最初用于連鎖分析主要是對基因多態性的估計, 現常用于表示微衛星DNA的變異程度, 反映微衛星位點多態性的高低。Botstein, et al.[21]首先提出了衡量基因變異程度的多態信息含量指標: 當PIC>0.500時, 表明該位點具有高度多態性; 當0.250

圖4 基于4個微衛星位點運算得到的7個大葉藻居群的STRUCTURE條形圖(K=2)Fig. 4 Structure bar plots (K=2) from four microsatellite loci for seven populations of Z. marina.

表3 分配模式檢驗得到的7個大葉藻居群在2個自由交配群中的分布比例Tab. 3 Proportion of seven populations of Z. marina in each two inferred clusters

大葉藻同時具有有性生殖和無性生殖兩種生殖策略, 但是大量研究證明大葉藻只進行有限的有性生殖, 這樣就限制了花粉的雜交, 基因的流動[22]。在有關大葉藻的研究調查中, 自交現象幾乎出現在每一個地點的居群中, 雜交的機率很小[3,5,15,20]。Campanella, et al.[5]提出大葉藻雜合度較低, 居群內自交高于雜交的特征似乎已經適應了它的生活環境,盡管至今尚無實驗完全證明這一觀點, 但是Palstra和Ruzzante[23]的確觀察到大葉藻居群大小大于最小理論有效居群大小。Wright[24]提出了Fst值分化程度范圍: 0.050

由自由交配估計(圖4)可以看出, 國內4個大葉藻居群幾乎全部被分配在二號自由交配群中, 與中國居群地理距離越遠的居群被分配到二號自由交配群的比例越少, 以致愛爾蘭居群幾乎全被分配到一號自由交配群中。由UPGMA樹也可以看出, 中國大葉藻居群首先聚類, 與韓國內浦居群聚類后, 再與日本東京灣居群聚類, 最后與愛爾蘭克萊爾郡居群聚類, 這與自由交配估計結果相吻合。西北太平洋海域的海草物種多樣性非常高, 在之前的大葉藻起源的探討中, 就曾有學者提出海草的東亞起源說[1,25,26]。由自由交配估計可以看出亞洲居群幾乎全部屬于二號自由交配群, 隨著地理距離的增加,二號自由交配群的比例大幅下降, 這一結果間接支持了海草東亞起源說。

目前, 盡管大葉藻的擴散途徑并不十分明確,但中國大葉藻與其他居群分屬不同的進化支, 遺傳距離較大, 基因流水平很低, 海運活動并不能促使中國、韓國、日本和愛爾蘭大葉藻居群間的基因交流, 據此推測地理隔離造成了大葉藻居群間的遺傳差異, 長時間的獨立進化和相互間缺乏基因流進而導致其分化。目前, 已有很多研究證實了地理隔離造成遺傳分化[13,27—31]。國內4個大葉藻居群并未表現出地理距離與遺傳的相關性, 可能是由于山東半島和遼東半島以前是一大片連續的海草場, 而青島灣和大連居群則是大海草場退化后的小片段居群,保留了更多的原始遺傳結構信息[3,32,33], 在小片段居群恢復期間, 受各自周邊復雜的水文棲息環境影響, 導致其發生不同的奠基者效應、瓶頸效應和遺傳漂變[5]。

微衛星標記的高變異率賦予其很強的檢測細微居群空間分化的能力[34]。在資源管理保護時, 微小的居群陽性分化對資源的安全具有重大意義。分辨率強而且可靠性高的微衛星標記研究適合于大葉藻資源管理, 但目前關于大葉藻的微衛星引物很少,而且并不一定都適用, 需開發新的微衛星標記。此外, 本研究所用的7個大葉藻居群地理跨度較大,雖然能反映一定的遺傳信息, 但由于沒有在大葉藻的分布范圍內連續采樣, 并不清楚大葉藻的擴散路徑及整體的遺傳結構特征。因此, 今后有必要增加樣品數量, 開發新的微衛星引物。

McKay, et al.[35]認為, 由于海草移植引進新的基因型或者單倍型, 可能造成兩方面的遺傳污染(Genetic pollution)。首先, 引入新的基因型或者單倍型可能產生較大的遺傳壓力, 導致海草移植修復的失敗。其次, 新引入的基因型植株可能在短時期內大量繁殖, 使早已適應本地環境的土著植株銳減,同樣沒有達到移植修復提高遺傳多樣性的目的; 而且不同的基因型植株都有不同的生活史, 其適應環境不同, 新引進的基因型植株可能并不適應新的生長環境, 致使成活率低下, 甚至全部死亡[36]。從本地環境中引入移植修復植株是至關重要的, 但是不能在不同地點間進行簡單的移植, 這樣可維持自然居群的遺傳結構。遺傳多樣性是移植中需要考慮的一個重要因素, 多樣性較低則可能不足以應對外間環境和繁殖策略的變化; 相反, 較高的遺傳多樣性可以應對外界環境的變化, 并且減少自交的幾率。大葉藻移植修復時, 應該采用遺傳多樣性高的本地居群, 并對遺傳多樣性低的居群進行重點保護。

致謝:

感謝江鑫博士、胡自民博士、郭棟、吳忠鑫以及日本東京大學小松輝久教授在樣品的采集過程中給予的極大幫助。

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GENETIC DIVERSITY IN POPULATIONS OF ZOSTER MARINA L. INFERRED FROM NUCLEAR SSR MARKERS

SUN Dian-Rong1, LI Yuan2, LI Wen-Tao2and GAO Tian-Xiang2
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Guangzhou 510300, China; 2. Institute of Evolution and Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Seagrasses are angiosperms that are thought to have become adaptive to aquatic environment independently. The marine, monocotyledonous Zostera marina is a species of Zosteraceae using traditional classifications, which widely distributes from subtropical to subfrigid coastal oceans. Seven natural populations of Z. marina (Lidao, Tian’ehu, Qingdao Bay, Dalian, Naepo, Tokyo Bay and Finavarra) were used in this study. To study the mechanism of the genetic diversity and population structure of the seven populations, microsatellite marker (SSR) analysis was done. A total of 57 alleles were identified in 148 individuals across the four microsatellite primers analyzed, with a mean value of 6 alleles per locus. The mean expected heterozygosity (He) and observed heterozygosity (Ho) across all populations were 0.687 and 0.417, respectively, and a higher level of diversity was found in the population from the Qingdao Bay (A=7.750, AR=7.043) than other populations. The minimum Fstvalue was 0.051 between the populations from the Qingdao Bay and Dalian. The maximum Fstvalue was 0.261 between the populations from Tian’ehu and Finavarra. The Fstvalues suggested moderate genetic differentiation within most of the Z. marina populations. From the UPGMA tree, four populations in China (Lidao, Tian’ehu, Qingdao Bay and Dalian) clustered together, and the genetic relationships may be attributed to eelgrass meadow fragmentation. The geographic distance was responsible for the genetic differentiation from large-scale among populations in China (Lidao, Tian’ehu, Qingdao Bay and Dalian), Korea (Naepo), Japan (Tokyo Bay) and Ireland (Finavarra). Results of possible number of clusters supported that this seagrass species originated from East Asia. The population from the Qingdao Bay has higher genetic diversity, suggesting that populations in this region demand prioritized conservation and utilization for breeding programs.

Zostera marina; Population; Microsatellite; Genetic diversity; Genetic structure

Q346

A

1000-3207(2013)01-0082-08

10.7541/2013.82

2011-10-24;

2012-10-09

海洋公益性行業科研專項(201105005); 國家自然科學基金(30700615)資助

孫典榮(1973—), 男, 廣東揭陽市人; 副研究員; 研究方向為海洋漁業與海洋生態研究。Tel: 020-89108341; E-mail: drsun73@163.com

高天翔, E-mail: gaozhang@ouc.edu.cn