長吻?養殖群體與野生群體遺傳多樣性分析

肖明松 崔 峰 康 健 馬玉涵

(安徽科技學院生命科學學院, 鳳陽 233100)

長吻?養殖群體與野生群體遺傳多樣性分析

肖明松 崔 峰 康 健 馬玉涵

(安徽科技學院生命科學學院, 鳳陽 233100)

長吻?(Leiocassis longirostris)是中國土著珍稀魚類。近年來, 由于江河水利工程、環境污染及人類生產活動已經對江河的漁業資源造成了難以逆轉的破壞, 長吻?的漁業資源已逐漸枯竭。目前, 長吻?在四川、廣東等地實現適度規模養殖。以四川眉山、湖北石首和安徽淮南3個人工養殖長吻?群體及4個長江野生長吻?群體(重慶段、武漢段、安慶段和南京段)為實驗材料, 利用線粒體DNA (mtDNA)控制區序列作為分子標記對135個個體的遺傳結構進行了分析。結果表明, 在790 bp 的同源序列中, 長吻?3個養殖種群共檢測到變異位點27個, 占全部序列的3.42%, 66個個體共檢測到18種單倍型; 在野生群體中, 69個個體共檢測到35個變異位點和36個單倍型, 長吻?野生群體平均單倍型多樣性和平均核苷酸多樣性(Hd = 0.9736±0.0070, Pi =0.0087±0.0015)高于長吻?養殖群體(Hd =0.8867±0.0013, Pi =0.0056±0.0013); 群體間的遺傳分化水平較低(Fst值為0.0014—0.1125)。采用鄰接法(NJ法)和統計簡約原理對所有單倍型進行系統發育樹和統計簡約網狀圖的構建, 結果表明: 各群體內的個體均不能分別構成獨立的分支, 而是相互交叉聚在一起。分析結果表明, 長吻?養殖群體與野生群體之間的基因交流充分, 未出現遺傳分化, 但相對長吻?野生群體, 長吻?養殖種群多態性偏低。

長吻?; mtDNA; 控制區; 序列分析

長吻?(Chinese longsnout catfish Leiocassis longirostris Günther) 隸屬鯰形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、?屬(Leiocassis), 俗稱:?魚、江團、肥沱、肥王魚、灰江團魚等, 為我國鯰形目分布最廣且產量較高的特產淡水名貴經濟魚類。其肉質細嫩、肉味鮮美且無細刺, 尤其是魚鰾特別肥厚, 含大量的膠蛋白, 是高級滋補品, 與燕窩、魚翅齊名, 被視為肴中珍品, 自古作為貢品之用, 也是一種貴重藥材。長吻?分布于中國東部的遼河、淮河、長江、閩江至珠江等水系及朝鮮西部, 以長江水系為主。近年來, 由于江河水利工程、環境污染、人類生產活動對自然資源的無節制掠奪等對江河的漁業資源造成了難以逆轉的破壞, 長吻?的漁業資源已逐漸枯竭。為促進長吻?繁殖和養殖迅速發展, 四川、廣東等地已獲得適度規模養殖[1—4]。目前, 有關長吻?生物學、生態學及養殖技術方面的研究有大量資料報道[5—8], 但與其相關的遺傳方面的研究則較少,僅在染色體組型、同工酶、微衛星引物篩選等方面有報道[9—12]。長吻?作為一個優良的養殖種類, 有必要對其種質及遺傳多樣性進行深入了解。魚類線粒體DNA(mtDNA)具有分子小、結構簡單、母系遺傳、進化速度快、幾乎不發生重組、不同區域進化速度存在差異等特點, 是一個相對獨立的復制單位。一個個體就代表一個母系集團, 便于進行群體分析。已被廣泛地應用于類群識別、地理隔離、起源、分化和擴散、遺傳多樣性等領域[13—17]。本研究利用mtDNA技術在分子水平上對來自安徽、湖北、四川3省長吻?的養殖群體和長江野生群體進行遺傳分析, 試圖了解天然群體和人工繁殖群體的遺傳結構以及遺傳多樣性, 以評價其種質狀況, 為種質資源研究、人工養殖及品種培育提供相關的遺傳背景資料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗魚 長吻?3個養殖群體分別來自四川眉山市長吻?原種場的子一代(22個個體, 2010年11月取樣)、湖北省石首市長吻?原種場的子一代(16個個體, 2010年12月取樣)、安徽省淮南市特種水產養殖場(28個個體, 2010年11月取樣), 均為1—2 齡的魚種, 體長8.0—30.6 cm; 體重16.8—351.5 g, 長吻?長江野生群體分別來自重慶段(23個個體, 2008年8月取樣)、武漢段(15個個體, 2008年8月取樣)、安慶段(16個個體, 2008年10月取樣)和南京段(15個個體, 2008年10月取樣), 均為2—3 齡的魚種,體長31.5—60.2 cm, 體重269.5—624.7 g(表1)。標本采用95%乙醇固定, ?20℃保存在安徽科技學院。

主要試劑 蛋白酶K、瓊脂糖、飽和酚購自上海生工生物工程技術有限公司, 引物DL1 (5′-AC CCCTGGCTCCCAAAGC-3′) 和DH2 (5′-ATCTTAG CATCTTCAGTG-3′)[18]由上海生工生物工程技術有限公司合成, Taq酶、dNTPs 購自大連TaKaRa公司;其他試劑均為國產分析純。

主要儀器 PCR 儀、核酸分析儀和離心機為Eppendorf (德國), Alphalmager Is-2200凝膠圖像分析系統(美國), 電泳儀等常規儀器均為國產。

1.2 方法

模板DNA的制備 每個樣品隨機取肌肉100—200 mg, 剪碎, 勻漿后置于1. 5 mL 的微量離心管中, 加入含蛋白酶K 的裂解液(10 mmol/ L Tris-HCl, pH 8. 0, 1 mmol/ L EDTA, pH 8. 0, 1%SDS) , 55℃消化過夜。次日分別用Tris-飽和酚、氯仿/異戊醇(24∶1) 提取、純化DNA, 之后用?20℃冷凍的無水乙醇沉淀DNA, 自然干燥后, 溶于滅菌雙蒸水中,所得用基因組DNA 樣品用紫外分光光度計測量DNA 樣品的濃度和純度, 同時輔以瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 的完整性并估測分子量, 置于?20℃冰箱保存備用。

PCR反應 PCR 反應總體積為30 μL, 其中含10×buffer反應緩沖液3.0 μL, 3 μL dNTP (2.5 mmol/L), 0.4 μmol/L 引物, 0.25 μL Taq 酶, 25 ng DNA, 用滅菌雙蒸餾水補足體積。PCR反應條件為: 94℃下預變性5min, 94℃下變性30s, 58℃下退火1min, 72℃下延伸1min, 共35個循環, 最后72℃下延伸10min, 4℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳 PCR 擴增產物在1.2 %的瓊脂糖凝膠(含0.5 g/mL EB) 上電泳, 120 V 穩壓電泳1h。電泳結果在Alphalmager Is-2200'凝膠圖像分析系統中拍照、保存。

DNA序列測定和分析 經2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 將PCR 產物送往上海生工生物工程技術有限公司進行序列測定, 測得的序列用Clustal X 1.81 程序[19]進行比對, 并輔以人工校對, 進行同源性比較。所有序列均遞交GenBank (序列號為JN131500-JN131517和AB054127-AY297099)。利用MEGA 3. 0 軟件包[20]分析序列特征、統計堿基組成和轉換與顛換值、計算遺傳差異和遺傳距離。采用鄰接法(Neighbor-joining tree, NJ)構建分子系統發育樹, 系統樹各分支的置信度由1000次自舉法(Bootstrap)檢驗。利用DnaSP 4.0軟件[21]計算各群體的單倍型多樣度(H)、平均核苷酸差異數(K)、核苷酸多態性(Pi); Arlequin 3.1軟件[22]進行群體間的歐氏距離平方(Squared euclidean distance) 矩陣分子變異分析(AMOVA), 統計長吻?養殖群體與野生群體間的遺傳分化指數(Fst), 并根據Nm≈(1?Fst)/(2Fst)得到群體間的基因流值(Nm)。為進行譜系生物地理學(Phylogeography)分析, 利用TCS 1.21[23]軟件, 依據統計簡約原理[24], 構建單倍型的網狀圖。相對于傳統的系統發育分析方法, 網狀圖更能夠有效地揭示種群水平上的譜系關系(Genealogical relationship),更清楚地反映與種內基因進化有關的特性, 如是否保持祖先的單倍型、是否存在多重后代的單倍型以及種群間的序列差異較低的特性[25]。

2 結果

2.1 長吻?線粒體控制區序列變異、單倍型和單倍型分布

利用引物DL1和DH2從所有長吻?個體的總DNA 中均成功擴增出790 bp 的線粒體控制區序列片段。在長吻?養殖群體所有可比較的790 bp序列中, 66個個體共檢測到27個變異位點(占全部堿基數的3.42%)。其中簡約信息位點18個, 單突變位點8個, 缺失位點1個。含有4個轉換位點(Ts), 1個顛換位點(Tv), 平均轉顛換比(Ts/Tv)為8.27。在長吻?野生群體中, 69個個體共檢測到35個變異位點(占全部堿基數的4.43%)。其中簡約信息位點24個, 單突變位點10個, 缺失位點1個。含有5個轉換位點(Ts), 1個顛換位點(Tv), 平均轉顛換比(Ts/Tv)為9.80。在長吻?養殖群體和野生群體中, 135個個體共檢測到42個變異位點, 其中簡約信息位點28個,單突變位點12個, 缺失位點2個(表1)。長吻?養殖群體和野生群體的堿基變化不大(表2), 其中堿基G的含量顯著低于其他堿基的含量, A+T含量(60.6%)明顯高于C+G含量(39.4%)。

2.2 單倍型分布及單倍型聚類分析

利用DnaSP 4. 0 軟件計算各群體的單倍型(表1)。由表1可知, 在長吻?不同群體中, 135個體共檢測出46 個單倍型, 即H-1 - H-46。其中28個獨享單倍型, 占20.74%, 18個共享單倍型, 單倍型H-8、H-11、H-12、H-14、H-18、H-24、H-37和H-43為野生群體和養殖群體共享。另外, 在長吻?養殖群體中, 66個體共檢測出18 個單倍型, 在野生群體中69個體共檢測出36 個單倍型(表略)。TCS 1.21軟件生成的統計簡約網狀圖顯示出星狀的分布態勢,沒有將46個單倍型區分為對應不同地理區域或者地理種群的單系群。單倍型H- 14位于星狀圖的中心,其他單倍型則與其依短支相連(圖1)。依據溯祖理論 (Coalescence theory), 線粒體控制區單倍型的星狀拓撲結構表明所研究的種群經歷了明顯的種群擴張[26], 單倍型H-14由于其分布最廣和享有該單倍型的個體在所有的種群中所占的比重也明顯的高于其他單倍型, 而且在網狀圖中處于基部位置, 說明單倍型H-14可能是原始的單倍型。

表2 長吻?序列堿基組成Tab. 2 Nucleotide compositions of mtDNA control region in Leiocassis longirostris

圖 1 基于線粒體控制區單倍型的統計簡約網狀圖Fig. 1 The statistical parsimony network inferred from mtDNA control region haplotypes

2.3 群體遺傳多態性參數統計

利用DnaSP 4. 0 軟件計算各群體的單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸差異數(K)、核苷酸多態性(Pi)。由表3可知, 長吻?4個野生群體的單倍型多樣性Hd值均較高, 而從衡量群體遺傳水平的K值和Pi值來看, 重慶野生群體明顯高于其他群體。長吻?3個養殖群體的平均單倍型多樣性和平均核苷酸多樣性相對較低 (Hd =0.8867±0.0013, Pi =0.0056± 0.0013)。

2.4 群體遺傳分化

群體間的序列差異反映的是生物間親緣關系的遠近, 使用MAGA 3. 0 軟件中Tamura-Nei 模型計算群體內及群體間的遺傳距離(表4)。結果表明, 四川眉山和湖北石首人工養殖群體間的親緣關系較遠,而安徽淮南養殖群體與湖北石首和四川眉山人工養殖群體間的親緣關系較近, 長吻?養殖群體與野生群體存在一定的遺傳距離。分子變異分析(AMOVA)的結果表明, 長吻?群體內存在較高的遺傳變異(96.42%), 而群體間的遺傳變異較小(3.21%) (表5),分子遺傳變異主要來自地理區內群體內個體間。7個群體兩兩比較的遺傳分化指數(Fst)顯示, 安慶群體和石首群體之間的遺傳分化最大(Fst=0.1125), 而武漢群體和安慶群體之間的遺傳分化最小(Fst= 0.0014), 其中長吻?養殖群體間的遺傳分化高于野生群體間的遺傳分化。 此外, 群體間的遺傳距離分析與遺傳分化指數的分析結果是一致(表4)。Arlequin 3.1 軟件統計養殖群體與野生群體間的遺傳分化指數和基因流分別為Fst=0.0358、Nm=13.47。

表3 長吻?7個群體遺傳多樣性統計參數Tab. 3 Demographic parameters estimated from seven Leiocassis longirostris populations

表4 長吻?群體間的遺傳分化指數(左下角)和遺傳距離(右上角)Tab. 4 Fixation Index (F) (below) and genetic distance (above) in three populations of Leiocassis longirostris

表5 長吻?群體分子變異分析結果Tab. 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) for the Leiocassis longirostris populations

2.5 群體間的親緣關系及聚類分析

利用MEGA 4. 0構建長吻?線粒體控制區核苷酸序列的NJ分子系統樹(圖2)。由圖2和表3 可知,各野生群體和養殖群體內的個體均未單獨成群, 而是互有交叉, 表明各野生群體和養殖群體的遺傳相似性系數較高, 親緣關系較近。

圖2 長吻?各單倍型基于線粒體控制區序列構建的NJ樹Fig. 2 NJ tree based on the control region of 7 populations of Leiocassis longirostris

3 討論

3.1 長吻?群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性的研究是生物多樣性研究的重要內容, 只有通過遺傳多樣性的研究才能從本質上揭示物種多樣性的起源、變異和進化。核苷酸多態性(Pi)作為一個衡量群體間遺傳多態性的重要指標, 表示各種mtDNA 單倍型在群體中所占的比例。由實驗結果可知, 在長吻?養殖群體中66個個體線粒體控制區790 bp的序列中, 總核苷酸突變位點為27個,共檢測出18個單倍型。長吻?野生群體中69個個體共檢測到35個變異位點, 36個單倍型。與長吻?野生群體相比, 養殖群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性水平均較低(Hd=0.8867±0.0013, Pi=0.0057± 0.0013)。另外, 從3個養殖群體內部的核苷酸位點突變情況來看, 安徽淮南群體內有22個核苷酸位點的變異, 湖北石首群體共產生12個變異位點, 四川眉山群體有17個變異位點, 分別只占總群體變異的81.48%、44.44%和62.96%。這表明遺傳變異主要存在于群體內, 群體間的基因變異較小。安徽淮南群體的基因多樣性水平最高, 石首和眉山河群體較低。Wang, et al.[27]對取自長江上游和下游的野生長吻?進行PCR–RFLP分析, 發現野生長吻?遺傳多樣性低, 種群數量下降, 這與已有野生種群的研究相一致[28,29]。而Yang, et al.[30]利用線粒體控制序列和核SSR標記研究長江上游、中游和下游野生長吻?遺傳變異和種群結構, 表明長江野生長吻?單倍型多樣性較高, 核苷酸多樣性水平較低(Hd=0.9770± 0.0041, Pi=0.0081±0.0043)。上述研究結果表明, 長吻?長期的人工養殖已使得該群體的遺傳多樣性水平明顯降低, 反映了長吻?作為我國鯰形目分布最廣且產量較高的特產淡水名貴經濟魚類特殊的生命進化歷程和適應復雜環境的能力。造成這一現象的主要原因可能是長吻?的基礎群體數量較小、養殖過程的近交及遺傳漂變等。而相對較高Hd值、低Pi值表明長吻?這個群體可能是由一個較小的有效群體迅速增長, 盡管變異導致單倍型的多態性的積累, 但核苷酸序列的多樣化還未能積累[31]。高的Hd為通過分子選育等技術有效防止品種退化提供了前提條件, 并為保持遺傳多樣性水平, 維持雜交選育優勢提供了重要基礎。這也在一定程度上說明定期補充不同地區不同群體的個體作為親魚進行繁育有利于保持長吻?人工繁殖群體的遺傳多樣性, 避免近親繁殖和瓶頸效應。

3.2 長吻?群體的遺傳結構分析

長吻?養殖群體的線粒體D-loop序列分析表明,平均(A+T)含量達60.6%, 明顯高于(C+G)含量, 該結果與其他鯰形目魚類線粒體控制區(A+T)含量特別高的研究結果相符[18]。群體間的遺傳距離以及種群分化指數是衡量群體多態程度的重要指標, 二者的值越大, 群體多態性程度越高[32]。根井正利利用遺傳相似指數IN和遺傳距離D 值對物種的不同分類單位間的遺傳變異水平作過定量估計,并指出種群間遺傳距離D 值的范圍是0—0.05; 亞種間是0.02—0.2[33]。本實驗結果表明, 3個養殖群體間的平均遺傳距離為0.005—0.006, 淮南群體與石首群體間的平均遺傳距離最小(0.005), 其他群體間的遺傳距離為0.006。4個野生群體間的平均遺傳距離為0.006—0.008, 重慶群體與武漢群體間的平均遺傳距離最大(0.008), 這反映長吻?養殖群體與野生群體之間的遺傳變異程度較小, 群體間的分化程度不大。長吻?7個群體兩兩比較的遺傳分化指數(Fst)顯示, 安慶群體和石首群體之間的遺傳分化最大(Fst=0.1125), 而武漢群體和安慶群體之間的遺傳分化最小(Fst=0.0014), 其中長吻?養殖群體間的遺傳分化高于野生群體間的遺傳分化, 長吻?養殖群體與野生群體間的遺傳分化指數為Fst=0.0358。根據Wright[34]關于遺傳分化指數的大小和分化程度的解釋, Fst值在0—0.05表示低度遺傳分化, Fst值在0.05—0.15表示中度遺傳分化, 由此說明長吻?養殖群體與野生群體間的親緣關系較近, 長吻?養殖群體的遺傳分化程度較低。Wright[35]認為群體間基因流大于1, 則能發揮均質化作用, 即能有效抑制由遺傳漂變而引起的遺傳分化反之, 如果群體間基因流小于1, 則不能有效抑制由遺傳漂變而引起的遺傳分化, 表明基因流成了遺傳分化的主要原因。本研究表明, 長吻?養殖群體與野生群體之間的Nm值達到13.47, 遠遠大于1, 可見其養殖群體與野生群體之間的基因交流比較充分, 從而抑制了由遺傳漂變導致的群體間遺傳分化。目前養殖的長吻?來源于野生的種群, 經過20多年的人工養殖和培育,已成為國內重要的淡水養殖魚類。在人工繁育過程中, 由于親本數量的限制和遺傳漂變, 導致一些多態和稀有位點的丟失, 隱性純合位點數增加, 使人工繁殖群體遺傳多樣性降低[36]。造成這種原因一方面可能是人工養殖長吻?時, 為得到其高質量和高產量, 人們經常篩選某一特定基因型的個體, 從而使某些基因從該基因庫中流失。此外, 近親交配也使得人工繁殖的長吻?遺傳多樣性下降。魚類遺傳多樣性是改良魚類品種和提高魚類品質的物質基礎, 遺傳多樣性的降低或被破壞會給漁業生產帶來損失[37]。因此長期的人工養殖已經對長吻?的遺傳結構產生了較大影響, 有必要從野生種群引種, 進一步豐富長吻?人工養殖群體的種質資源和遺傳多樣性。

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ANALYSIS ON SEQUENCE POLYMORPHISM OF THE MITOCHONDRIAL DNA CONTROL REGION AND POPULATION GENETIC DIVERSITY OF THE CULTIVATED AND NATURAL CHINESE LONGSNOUT CATFISH (LEIOCASSIS LONGIROSTRIS)

XIAO Ming-Song, CUI Feng, KANG Jian and MA Yu-Han
(College of Life Science Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

The Chinese longsnout catfish is a semi-migratory fish which is commercially valuable in China. Due to overfishing, environmental pollution, and other human disturbances, the populations of this species have declined rapidly and disappeared in many river systems in the past decades. Currently, the Chinese longsnout catfish mainly inhabits the main streams of the Yangtze River and rarely found in lakes. At present, the Chinese longsnout catfish achieved appropriate scale farming in Sichuan, Guangdong and other places. However, seldom study was reported about analysis of population genetic structure using molecular markers. To protect and exploit this rare species effectively, investigations on population structures, resources and artificial reproduction have been conducted. In this study, the mitochondrial DNA control region were used to analyze genetic diversity and structure of 7 cultivated and natural populations of Chinese longsnout catfish collected from Meishan, Shishou, Huainan, Chongqing, Wuhan, Anqing and Nanjing named Meishan population, Shishou population, Huainan population, Chongqing population, Wuhan population, Anqing population and Nanjing population separately. The results showed the length of this region (D-loop) contained 790 bp nucleotides and the T, C, A and G contents were 31.5%, 25.3%, 29.1% and 14.1% respectively. Twenty-seven nucleotide sites and 18 haplotypes were found in 3 cultivated populations of Chinese longsnout catfish. Thirty-five nucleotide sites and 36 haplotypes were found in 4 natural populations of Chinese longsnout catfish. The average haplotype diversity and nucleotide diversity of cultivated populations of Chinese longsnout catfish were relatively low (Hd =0.8867±0.0013, Pi =0.0056±0.0013). The level of genetic differentiation was relatively low (0.0014—0.1125). Molecular phylogenetic tree and statistical parsimony network constructed by NJ method and statistical parsimony principles showed individuals from the same stock did not cluster together, and individuals from three different stocks nested with each other. These results suggested gene flow was sufficient between breeding populations and wild populations. They had no obviously genetic differentiation between breeding populations and wild populations. The genetic diversity of the cultivated populations of Chinese longsnout catfish was low.

Leiocassis longirostris; mtDNA; Control region; Sequencing

Q346

A

1000-3207(2013)01-0090-10

10.7541/2013.90

2012-02-09;

2012-09-05

安徽省教育廳重點科研項目(KJ2011Z069); 安徽科技學院穩定人才項目(ZRC2011257); 安徽科技學院預研項目(ZRC 2012312)資助

肖明松(1973—), 男, 安徽定遠人; 副教授, 博士; 主要從事漁業生態和分子進化研究。E-mail: xiaomingsong2004@126. com