四湖總干渠環境雌激素不同濃度江段?繁殖生物學比較研究

郭嫦娟廖 濤柳 明謝松光

(1. 中國科學院水生生物研究所, 中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢430072; 2. 中國科學院大學,

北京 100049; 3. 湖北省環境科學研究院, 武漢 430072; 4. 湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所, 武漢430064; 5. 中國科學院水生生物研究所淮安研究中心, 淮安223002)

四湖總干渠環境雌激素不同濃度江段?繁殖生物學比較研究

郭嫦娟1,2,3廖 濤4柳 明1謝松光1,5

(1. 中國科學院水生生物研究所, 中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢430072; 2. 中國科學院大學,

北京 100049; 3. 湖北省環境科學研究院, 武漢 430072; 4. 湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所, 武漢430064; 5. 中國科學院水生生物研究所淮安研究中心, 淮安223002)

選取湖北四湖總干渠污染水平不同的3個江段(A、B、C), A離源頭較近, B位于一農藥廠排污口下方, C位于一城鎮居民排污口下方, 比較?繁殖群體的生物學特征。A江段水體中未檢測出環境雌激素, 而B、C兩江段主要含有壬基酚和雙酚A, 兩種污染物總濃度在20 μg/L左右。與A江段相比, B、C江段?繁殖群體中雌性個體的比例明顯較高, 卵粒較小; 雄性個體精巢組織間隙增大, 精原細胞和精子細胞密度低; 肝體指數增大、肝組織出現大量空泡, 肝細胞密度降低等特點。壬基酚和雙酚A已被證明具有顯著的雌激素活性和生殖毒性。因此, B、C江段壬基酚和雙酚A環境雌激素濃度較高可能是導致?繁殖群體生物學特征改變的重要原因。

環境雌激素; 壬基酚; 雙酚A;?; 繁殖生物學特征

環境雌激素(Environmental estrogens, EEs)是指干擾生物體內源激素的合成、分泌、運輸、結合和代謝等過程的外源性化學物質[1]。我國主要河流水系及沿海地區水體均不同程度受到環境雌激素的污染。多氯聯苯(PCBs)、壬基酚、雙酚A、鄰苯二甲酸酯類等有機化工原料類一般在南方水體檢出率較高, 有機氯農藥和生活用水排放是這些環境雌激素的主要來源[2]。環境雌激素對生態環境和人類健康的影響已受到社會的廣泛關注。

大量實驗室毒性實驗證明, 環境雌激素影響魚類的生長和繁殖[3—5], 這種個體水平的影響可能進一步影響魚類的種群動態。然而有關自然水體中環境雌激素的生物學效應研究還很少。?(Hemiculter Leucisculus)隸屬于鯉形目(Cyprinidae)、鯉科(Cyprinidae)、?屬, 是生活于水體中上層的小型魚類, 在我國分布廣泛[6]。?分批產卵, 繁殖季節為4—8月, 5—6月為盛季。本文選擇湖北省境內四湖總干渠, 比較環境雌激素不同濃度江段?繁殖群體的生物學特征, 為評價環境雌激素對魚類的影響效應提供自然水體的證據。

1 研究地點

四湖總干渠源于湖北荊州地區, 經潛江、監利、洪湖至新灘口匯入長江, 全長100多km[7]。沿途城鎮生活污水、工業廢水和農田用水排入總干渠[8]。總干渠中沒有魚類放養和漁業捕撈。

采樣在A、B、C三個河段進行。其中A段(30°21′49″N/112°30′12″E)離源頭較近, 水質良好; B段(30°11′09″N/112°36′09″E)位于一個農藥廠排污口下方; C段(30°03′24″N/112°54′21″E)位于某城鎮排污口下方。

2 材料與方法

2.1 主要儀器與試劑

波恩氏液(苦味酸飽和水溶液∶甲醛∶冰醋酸為15∶5∶1); 肝素鈉溶液(用無菌水配成1 mg/mL的濃度, 4℃保存); 5%甲醛溶液, 無水乙醇, 濃H2SO4(上海國藥); 雌激素標準品(Sigma公司); 色譜分析中的乙酸乙酯、甲醇、正己烷為農藥級, 乙腈為色譜純。

電子天平 (0.001 g)(SHIMADZU- BL-320H)、GCMS(Agilent 7890A-5975C); Oasis HLB柱(Waters)、光學顯微鏡(OLYMPUS BX51)、解剖鏡(OLYMPUSSZX16)、輪轉式切片機(LEICA -RM2235) 。

2.2 樣品采集與處理

采樣于2009年6月19日和20日進行, 采用流刺網(長: 17 m, 寬1 m, 網目: 2.0 cm)采集?繁殖群體, 每個采樣點采集30尾以上。樣品采集后立即置于冰塊中保存, 帶回實驗室后測定標準體長(Standard length, SL, 0.1 mm)、稱體重(Body weight, BW, 0.01 g); 將腹部剖開, 觀察性腺, 確定性別和性腺發育狀況; 選擇性腺發育成熟雌魚, 分離部分卵巢, 稱重后固定于5%的福爾馬林溶液中, 在解剖鏡下測定卵徑; 取出肝臟、稱重(Liver weight, LW, 0.001 g), 肝體指數(HSI)采用以下公式計算:

取部分肝臟和精巢組織, 在波恩氏液中固定12—24h后, 轉入70%乙醇溶液中保存, 用于組織切片和觀察。切片時依次采用乙醇梯度濃度脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋, 切片, 烘片, 二甲苯脫蠟、系列乙醇復水, 蘇木精—伊紅染色, 乙醇脫水、二甲苯透明, 中性樹膠封片, 在顯微鏡下觀察并拍照。

魚類采集同時用采水器采集表層水樣3 L, 現場用濃硫酸固定, 采用0.45 μm濾膜過濾, 用濃硫酸將pH調為3左右, 保存于4℃, 48h內進行環境雌激素分析。測定時采用固相萃取方法對樣品進行濃縮分離, 采用氣相色譜與質譜聯用GC-MS的方法測定水樣中環境雌激素濃度[9]。

2.3 數據處理

采用嵌套方差分析(Nested ANOVA)檢驗不同樣點間卵徑差異顯著性。采用雙因子方差分析(Twoway ANOVA)和最小顯著差數法(LSD)檢驗不同樣點、性別的?HSI的差異顯著性。顯著性檢驗的顯著水平為P<0.05。統計分析采用 STATISTICA 6.0進行。

3 結果

3.1 不同江段內分泌干擾物濃度

A河段水樣中沒有檢測出環境雌激素, B、C兩河段水樣中均檢測出壬基酚和雙酚A兩種環境雌激素, B、C兩河段間兩種污染物濃度均無顯著性差異(表1)。

3.2?繁殖生物學指標

A、B、C三個樣點分別采集?繁殖群體個體51尾、41尾和39尾, 其中雌魚所占比例分別為39%、58%和61%。污染點B、C的雌魚所占比例高于對照點A (表1)。

樣點對卵徑存在顯著的影響(Nested ANOVA, P<0.05), 多重比較表明A樣點卵徑平均值顯著大于B、C樣點, B、C樣點間卵徑平均值差異不顯著(表1)。

3.3 肝體指數和肝臟切片

采樣點和性別對HSI均存在顯著差異(two-way ANOVA)。A樣點雌性和雄性個體的HSI均顯著低于B、C樣點(P<0.05); 三樣點中雌性個體的肝體指數均顯著高于雄性個體(P<0.05)(表1)。

不同采樣點?肝臟切片均存在明顯的差異。A樣點?的肝細胞排列緊密, 細胞核清晰, 細胞質豐富(圖1A); B、C樣點?的肝組織出現大量空泡、孔洞, 肝細胞密度降低, 細胞核不明顯(圖1B, C)。

表1 湖北四湖總干渠不同采樣江段(A、B、C)環境雌激素水平和?繁殖群體的生物學特征Tab.1 The levels of environmental estrogen in the water and the reproductive characteristics of Hemiculter leucisculus at the three sampling sections (A, B and C) in the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province

圖1 四湖總干渠不同江段?肝臟組織切片顯微照片Fig. 1 The liver histological pictures of Hemiculter leucisculus from different sections of the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province

3.4 精巢切片

不同采樣河段?精巢組織切片存在明顯差異(圖2)。A樣點?的精巢發育良好, 生精小葉直徑很大, 排列緊密, 小葉間結締組織豐富, 各個時期的細胞染色質豐富, 嗜堿性強, 被染成深色(圖2A1, A2); B、C兩樣點?精巢中空顯著較大, 結締組織壞死或斷裂, 精原細胞和精子細胞密度都明顯下降,表明生精過程受阻, 精巢的發育受到抑制(圖2B1, B2, C1, C2)。

4 討論

四湖總干渠源頭A江段水體未檢測出環境雌激素, 而B、C兩江段主要含有壬基酚和雙酚A, 兩種污染物總濃度均在20 μg/L左右。與A江段相比, B、C江段?繁殖群體中雌性個體的比例明顯較高, 卵粒較小; 雄性個體精巢中空增大, 結締組織壞死或斷裂, 精原細胞和精子細胞密度低; 肝體指數增大、肝組織出現大量空泡, 肝細胞密度降低、細胞核不明顯等特點。壬基酚和雙酚A等一類污染物已經被證明具有顯著雌激素活性[10,11]。由于這些環境雌激素化學結構與魚體內生理合成的雌激素十分相似,可以與體內雌激素受體結合, 影響相關內源雌激素的合成、釋放、輸送、代謝、結合、作用或消除過程, 進而影響魚類的早期生長發育、性別分化、繁殖等[12,13]。雙酚A對斑馬魚的生殖有明顯的抑制作用, 而壬基酚和雙酚A具有協同效應甚至中斷生殖行為[14]。B、C江段水體中壬基酚和雙酚A濃度較高可能是導致?繁殖群體生物學特征改變的重要原因。

水體中的環境雌激素能夠影響魚類性別決定過程, 對魚類產生明顯的雌性化效應, 改變魚類個體內源激素表達水平, 從而引起種群性比改變。如英國調查報告表明, 生活在工廠排污河流的石斑魚發生了嚴重的雌性化現象[15], 在諾福克郡的艾爾河觀測點, 接受調查的雄性石斑魚60%出現了雌性化的特征, 雌性石斑魚比例顯著高于對照點[16]。在本研究中B、C江段?繁殖群體的雌性個體比例較高可能與該江段中壬基酚和雙酚A的雌激素效應相關, 與以上文獻報道結果一致。

精巢是環境雌激素可以直接產生作用的靶器官。Bjerselius, et al.[17]和Gimeno, et al.[18]分別發現雌激素暴露下的雄性鯽魚和雄性鯉魚都會產生精子數量下降, 甚至沒有精液的現象。Jobling, et al.發現暴露在壬基酚中的虹鱒雄性生殖腺的生長受抑制[19]。雙酚A對斷乳期F1雄性子代大鼠生殖和發育有影響, 可能導致生精細胞凋亡增強, 增殖減慢, 細胞內轉錄、表達受阻[20]。隨著環境雌激素濃度的增加,有可能使動物精巢中的一些細胞凋亡或者壞死的速度增加[21]。在本研究中環境雌激素污染物濃度較高的B、C江段?精巢組織結構破壞與以上環境雌激素效應一致。

進入生物體內的壬基酚和雙酚A必須通過肝臟的代謝才能排除體外, 在內分泌干擾物的刺激下,混合功能氧化酶等肝臟解毒酶的誘導效應致使肝細胞腫大, 肝臟增大[22]。劉萍發現暴露于壬基酚、雙酚A、辛基酚和17β-雌二醇這四種化合物中的金魚HSI較對照組顯著升高[23]。而B、C點?肝臟細胞腫大, 核萎縮變形, 細胞空泡化以及局部肝組織壞死, 與環境雌激素作為外源異生物質在肝中的代謝密切相關。

雖然已經有很多受控實驗證明環境雌激素對魚類繁殖的影響, 但野外原位實驗直接證據還較少。本研究顯示在自然環境中, 環境雌激素濃度較高的水體, 魚類繁殖群體的繁殖生物特征顯著改變, 可能導致魚類精子和卵子質量降低、繁殖成功率下降等, 從而影響魚類種群數量和結構。很多天然水體都受到環境雌激素不同程度的污染, 如我國黃河口表層水體壬基酚平均值為47.5 ng/L[25], 珠江三角洲河段為0.02—0.165 μg/L[26], 北黃海近岸濃度為15.13—762.73 ng/L[27]。有關環境雌激素污染物對魚類種群動態的影響需要通過研究環境雌激素污染水體相關魚類的種群動力學特征進一步闡述。

[1] Campbell C G, Borglin S E, Green F B, et al. Biologically directed environmental monitoring, fate, and transport of es trogenic endocrine disrupting compounds in water: a review [J]. Chemosphere, 2006, 65(8): 1265—1280

[2] Zhang Q, Bao L Y, Liu W J, et al. Current status of endo crine disrupting chemicals pollution in drinking water source of China [J]. Environmental Science & Technology, 2011 34(2): 91— 96 [張琴, 包麗穎, 劉偉江, 等. 我國飲用水水源內分泌干擾物的污染現狀分析. 環境科學與技術, 2011 34(2): 91— 96]

[3] Lauren T Moffatt, Chelsea L May, Kirsten E Studer, et al Effects of exposure water volume, depuration time, and feed ing status on vitellogenin mRNA induction in male medak (Oryzias latipes) exposed to 17 β-estradiol [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2010, 73(8): 1835—1841

[4] Andersen L, Holbech H, Gessbo A, et al. Effects of exposur to 17a-ethinylestradiol during early development on sexua differentiation and induction of vitellogenin in zebrafish (Danio rerio) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology and Pharmacology, 2003, 134(3): 365—374

[5] Kang I J, Yokota H, Oshima Y, et al. Effect of 17 β-estradio on the reproduction of Japanese medaka (Oryzias latipes) [J] Chemosphere, 2002, 47(1): 71—80

[6] Zhu S Q. Synopsis of Freshwater Fishes in China [M]. Nan jing: Jiangsu Science and Technology Press, 1995, 39 [朱松泉. 中國淡水魚類檢索. 南京: 江蘇科學技術出版社. 1995, 39]

[7] Li C F, Zhang H H. A study on the effect of human activities on water environment in Four Lake area since 1950s [J]. Territory & Natural Resources Study, 2003, (4): 68—70 [李昌峰, 張鴻輝. 建國以來人類活動對湖北省四湖地區水環境的影響研究. 國土與自然資源研究, 2003, (4): 68—70]

[8] Anna-Kristina B, Peter B. Quantification of anthropogenic threats to lake in a low and county of central Sweden [J]. A Journal of The Human Environment, 2001, 30(3): 127—128

[9] Takeda S, Iida S, Chayama K, et al. Separation of bisphenol A and three alkylphenols by micellar electrokinetic chromatography [J]. Journal of Chromatography Part A, 2000, 895(1/2): 213—218

[10] Drastichova D, Svobodova Z, et al. Effect of exposure of bisphenol A and 17β-estradiol on the sex differentiation in zebrafish (Danio rerio) [J]. Acta Veterinaria Brno, 2005, 74(2): 287—291

[11] Hill R L, Janz D M. Developmental estrogenic exposure in zebrafish (Danio rerio): I. Effects on sex ratio and breeding success [J]. Aquatic Toxicology, 2003, 63(3): 417—429

[12] Liu A P, Wang W M. Influence of Endocrine Disrupting Chemicals on fish [J]. Reservoir Fisheries, 2007, 27(1): 1—3 [劉阿朋, 王衛民. 環境內分泌干擾物對魚類的影響. 水利漁業, 2007, 27(1): 1—3]

[13] Xia J G, Niu C J, Fu J H, et al. Ecotoxicological effects of exposure to nonylphenol on courtship behavior of zabrafish Danio rerio [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(6): 1142—1148 [夏繼剛, 牛翠娟, 傅俊華, 等. 壬基酚對斑馬魚求偶行為的生態毒理效應. 水生生物學報, 2012, 36(6): 1142—1148]

[14] Cao N, Wei H, Wu L G, et al. Effects of bisphenol A on zebrafish (Danio rerio) liver and gonad [J]. Chinese Journal of Ecology, 2010, 29(11): 2192—2198 [曹娜, 魏華, 吳陵廣,等. 雙酚A對斑馬魚肝臟和性腺的作用. 生態學雜志, 2010, 29(11): 2192—2198]

[15] Petrovic, Eljarrat, Alda, et al. Recent advance in the mass spectrometric analysis related to endocrine disrupting compounds in aquatic environmental samples [J]. Journal of Chromatography A, 2002, 974(1/2): 23—29

[16] Korsgarrs, Andreassen, Rasmussen. Effect of an environmental estrogen, 17α-ethinyl-estradiol, on the matemal-fetal trophic relationship in the eelpout Zoarces viviparous (L) [J]. Marine Environmental Research, 2002, 54: 735—739

[17] Bjerselius R, Lundstedt-Enkel K, Olsen H, et al. Male goldfish reproductive behaviour and physiology are severely affected by exogenous exposure to 17β-estradiol [J]. Aquatic Toxicology, 2001, 53(2): 139—152

[18] Gimeno S, Komen H. Feminisation of young males of the common carp, Cyprinus carpio, exposed to 4-tert-pentylphenol during sexual differentiation [J]. Aquatic Toxicology, 1998, 43(1): 77—92

[19] Jobling S, Tyler C R. Endocrine disruption in wild freshwaterfish [J]. Pure and Applied Chemistry, 2003, 75(11): 2219—2234

[20] Lü B, Cao X Q, Yao Y G, et al. The effects of bisphenol a on the reproduction and development of F1 male rats furing weaning period [J]. Modern Preventive Medicine, 2010, 37(12): 2216—2219 [呂波, 曹顯慶, 姚永革, 等. 雙酚A對斷乳期SD大鼠F1子代雄性生殖發育影響. 現代預防醫學, 2010, 37(12): 2216—2219]

[21] Harries J E, Runnalls T, Hill E, et al. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas) [J]. Comparative Environmental Science Technology, 2000, 34(15): 3003—3011

[22] Fang JKF, Au DWT, Wu RSS, et al. The use of physiological indices in rabbitfish Siganus oramin for monitoring of coastal pollution [J]. Marine Pollution Bulletin, 2009, 58(8): 1229—1244

[23] Liu P, Li Z Y, Li J L. Estrogenic effects of vitellogenin induction in goldfish caused by phenolic compounds [J]. Periodical of Ocean University of China, 2010, 40(11): 134—140 [劉萍, 李正炎, 李江玲. 酚類污染物對金魚卵黃蛋白原誘導的雌激素效應研究. 中國海洋大學學報, 2010, 40(11): 134—140]

[24] Yin M C. Fishes Ecology [M]. Beijing: Chinese Agricultural Press. 1995, 134—272 [殷名稱. 魚類生態學. 北京:中國農業出版社. 1995, 134—272]

[25] Sun P Y, Li Z Y, Wang X P. Distribution characteristics of nonylphenol pollutant in the yellow river mouth area [J]. Coastal Engineering, 2007, 26(3): 17—22 [孫培艷, 李正炎,王鑫平. 黃河入海口壬基酚污染分布特征. 海岸工程, 2007, 26(3): 17—22]

[26] Duan J C, Chen B, Mai B X, et al. Survey of Alkylphenols in aquatic environment of Zhujiang Delta [J]. Environmental Science, 2004, 25(3): 48—52 [段菁春, 陳兵, 麥碧嫻, 等.洪季珠江三角洲水系烷基酚污染狀況研究. 環境科學, 2004, 25(3): 48—52]

[27] Liu W P, Shi X Y, Wang X B, et al. Survey of nonylphenol in Liaoning coastal aquatic environment of North Yellow Sea and the ecological risk assessment [J]. Marine Environmental Science, 2009, 28(6): 664—667 [劉文萍, 石曉勇, 王曉波,等. 北黃海遼寧近岸水環境中壬基酚污染狀況調查及生態風險評估. 海洋環境科學, 2009, 28(6): 664—667]

A COMPARATIVE STUDY ON REPRODUCTIVE BIOLOGY OF HEMICULTER LEUCISCULUS FROM DIFFERENT SECTIONS OF THE MAIN IRRIGATION CHANNEL WITH VARIED LEVELS OF ENVIRONMENTAL ESTROGENS

GUO Chang-Juan1,2,3, LIAO Tao4, LIU Ming1and XIE Song-Guang1,5
(1. State Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation of Chinese Academy of Sciencies, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Hubei Academy of Environmental Sciences, Wuhan 430072, China; 4. Institute of Farm Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China; 5. Huai’an Research Center, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Huai’an 223002, China)

Reproductive characteristics were compared for Hemiculter leucisculus which collected from 3 sections of the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei province with different levels of environmental estrogens. Section A was in the upstream of the channel; section B was below an outlet of a pesticide factory, and section C was below the sewage outlet of a town. No environmental estrogens were detected in section A. Both nonylphenol and bisphenol-A were detected in sections B and C with the total concentrations about 20 μg/L in each sections. H. leucisculus in B and C showed higher percentage of female, and smaller egg size when compared with the fish from section A. Histological observation on the testis showed enlarged tissue interval and lower densities of spermatogonium and spermatid for males from sections B and C. Meanwhile, the fish from sections B and C had higher hepatosomatic index and lower density of liver cell with the occurrence of some histological vacuoles in liver compared to the fish from section A. Both nonylphenol and bisphenol-A were demonstrated of estrogen activity and reproductive toxicity. High concentrations of them in the B and C sections should likely contribute to the variations in reproductive characteristics of H. leucisculus there compared to the A section.

Environmental estrogens; Nonylphenol; Bisphenol A; Sawbelly (Hemiculter leucisculus); Reproductive biology

Q142

A

1000-3207(2013)01-0139-06

10.7541/2013.139

2011-10-27;

2012-11-21

淡水生態與生物技術國家重點實驗室開放課題(Y15C01); 湖北省農科院青年科學基金項目(2012NKYJJ17)資助

郭嫦娟(1987—), 女, 湖北省潛江市人; 碩士; 研究方向為魚類生態學。E-mail: cjguo@yahoo.cn

謝松光, E-mail: xiesg@ihb.ac.cn