高原低氧環境下結締組織生長因子在正常和不同病變胃黏膜中的表達

祁永清，李菊英，賀菊香，王海燕

胃腸道是對氧較敏感的器官,低氧環境引起唾液腺分泌減少,參與消化的腸淀粉酶亦減少,這影響到高原人消化吸收功能,也是高原地區慢性胃炎,尤其是慢性萎縮性胃炎高發原因之一。胃癌是高原地區最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著本地區居民的生命健康，為探討在高原低氧環境下不同病變胃黏膜組織中結締組織生長因子(CTGF)的陽性表達，早期診斷胃黏膜的不同病變，為胃癌的預防及早期診斷提供理論依據，本研究觀察了青海高原地區患有慢性萎縮性胃炎及胃癌患者的病變胃黏膜和正常胃黏膜中CTGF的表達情況,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2007年7月—2008年3月青海大學附屬醫院行胃鏡檢查并符合慢性萎縮性胃炎的患者20例，鉗取2～4塊，中性固定液固定，經病理確診并資料完整，其中男10例，女10例；年齡28～74歲，平均(47.3±8.0)歲。均未接受過治療。慢性萎縮性胃炎的診斷參考2006年中國慢性胃炎共識意見[1]，分為慢性萎縮性胃炎腸上皮化生12例和非化生性慢性萎縮性胃炎8例。另收集同時期青海大學附屬醫院送檢病理科的胃癌切除標本50例，其中男41例，女9例；年齡35～80歲，平均(55.7±4.0)歲。均經病理證實為胃癌，高分化8例，中分化15例，低分化27例。取同時期體檢時行胃鏡檢查的健康者10例，并在本人自愿情況下鉗取2～4塊正常胃黏膜,其中男7例，女3例；年齡35～70歲，平均(51.8±5.0)歲。

1.2 主要試劑 鼠抗人多克隆CTGF濃縮型工作液購自美國R&D system corporation,HistostainTM-plus kits 試劑盒工作濃度比例1∶10，濃縮型DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)和檸檬酸抗原修復液均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3 方法 所有標本經10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，連續切片，切片厚度4 μm，切片經過二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水，用0.01 mol/L pH值7.2 的PBS漂洗3次，5 min/次，擦干組織周圍的水分，加3%過氧化氫(H2O2)封閉內源性過氧化物酶，室溫10 min，PBS洗3次，5 min/次，切片放入0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復液中高壓間接抗原修復10 min，室溫冷卻，PBS洗3次，5 min/次，加一抗，4 ℃冰箱過夜。PBS洗3次，5 min/次，用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗37 ℃溫箱1 h，PBS洗3次，5 min/次，新鮮配制的二氨基聯苯氨(DAB)顯色液進行顯色，蘇木素復染，逆梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作陰性對照，用光學顯微鏡進行觀察。

1.4 結果判定標準 免疫組織化學染色結果的判讀，陽性細胞數<25%為(+),25%～50%為(++),>50%為(+++),無陽性細胞(-)。(+～+++)為陽性表達，(-)為陰性表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS 12.0統計學軟件進行處理，計數資料多組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義，組間兩兩比較檢驗水準α′=0.0083。

2 結果

2.1 CTGF在不同胃黏膜的光學顯微鏡表現 正常胃黏膜中，胃腺排列整齊，形態規則，CTGF在大多細胞中沒有表達，只散在表達在胃小凹腺體頸部細胞胞質和胞膜中(見圖1)。慢性萎縮性胃炎中，胃腺體數量減少、胃小凹變淺，CTGF彌漫表達(見圖2)。胃癌組織中CTGF彌漫表達，且染色較深(見圖3)。

圖1 正常胃黏膜CTGF的陽性表達(×40)

圖2 慢性萎縮性胃炎CTGF的陽性表達(×40)

圖3 胃癌組織中CTGF的陽性表達 (×40)

2.2 CTGF在不同胃黏膜的表達 正常胃黏膜中CTGF陽性表達1例(1/10)；慢性萎縮性胃炎腸上皮化生組織中CTGF陽性表達11例(11/12)；非化生性慢性萎縮性胃炎組織中CTGF陽性表達4例(4/8)；胃癌組織中CTGF陽性表達32例(64%),差異有統計學意義(χ2=16.097,P=0.0011)。慢性萎縮性胃炎腸上皮化生、胃癌組織中CTGF陽性表達率較正常胃黏膜中升高，差異均有統計學意義(χ2值分別為14.673和9.818，P值分別為0.0001和0.0017)。慢性萎縮性胃炎腸上皮化生、非化生性慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中CTGF陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.0083)。

3 討論

對青海地區正常胃黏膜和不同病變胃黏膜研究發現：在正常胃黏膜組織中CTGF只表達在胃小凹頸部細胞的胞質中，在慢性萎縮性胃炎腸上皮化生組織中CTGF彌漫表達，與正常胃黏膜比較差異明顯。胃癌組織中CTGF亦呈彌漫強陽性表達，與正常胃黏膜比較差異明顯，但與慢性萎縮性胃炎沒有明顯差異，這與文獻報道的一致[2]，但發生的機制有待進一步研究。

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一,其發病率和病死率均居惡性腫瘤前列。早診斷、早治療是目前提高胃癌患者生存率的惟一有效措施。臨床胃鏡活組織檢查的廣泛應用使早期胃癌的診斷成為可能。但臨床實踐發現，胃鏡活組織檢查技術對早期胃癌的檢查率并無很大提高，大部分胃癌患者診斷時已屬于晚期，其主要原因可能與對胃癌前期變化認識不夠充分、不能為臨床提供可靠的胃黏膜癌前病變隨訪資料有關。為了對胃癌的早期診斷提供可靠的理論依據，本研究探討青海高原地區患有慢性萎縮性胃炎及胃癌患者的病變胃黏膜組織和正常胃黏膜組織中CTGF的表達情況，在慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化組織中，如果CTGF表達陽性，一定要引起高度警惕，積極有效治療的同時要密切注意胃黏膜改變。但本研究中由于例數較少，不排除出現假陽性的可能，在以后的研究中應加大樣本進一步證實。

CTGF是20世紀90年代初在血小板源性生長因子(PDGF)的誘導下從人臍周靜脈內皮細胞cDNA文庫中首次發現的，可由成纖維細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞等多種細胞合成分泌。 CTGF屬于即刻早期生長反應性基因，定位于許多細胞的細胞核中，它與細胞增殖、分化、凋亡、黏附、胚胎發育以及傷口愈合等有關[1]；是一種功能的分泌蛋白，在不同的腫瘤所起的作用有所不同[3]。在成人結締組織、心、腦、腎[4]、肺[5]、肝、肌肉、胰腺以及胎盤等組織都有CTGF的表達。同時多個研究發現除了正常生理表達之外，在人類一些疾病中，如在黑色素瘤[6]、類風濕性關節炎[7]和一些良惡性腫瘤等疾病中CTGF均有不同程度的表達，與疾病的發生發展有著密切的關系。有資料顯示，結腸癌黏膜CTGF表達比正常結腸高，而且與分化程度有關，在低分化結腸癌中高表達[8]。在膽囊癌中CTGF比膽囊炎、正常膽囊黏膜中表達高[9]。本研究提示如果在胃鏡鉗取的胃黏膜組織中檢測出CTGF，可能對胃癌的早期診斷有很大的幫助，所以CTGF的檢測可以用于胃癌的癌前病變的篩選，不僅可以提高對胃癌發病的認識，而且對胃癌的預防有實際意義。高原環境具有氧分壓低、紫外線強、氣候多變等特點,是一個特殊的生態環境系統。高原低氧引起胃腸功能紊亂，胃腸蠕動減慢，胃排空時間延長，胃內容物滯留，易引起胃黏膜病變，文獻報道高原地區慢性胃炎發病率高，且海拔越高，發病率越高[10]。考慮其原因與長期處于高原缺氧環境，造成急性胃炎的上述因素持續存在有關。慢性萎縮性胃炎又是癌前病變,胃癌的發生被認為是從胃黏膜炎癥開始的一個逐漸累積的過程，隨著病變的發展，在組織學上逐步發展成癌前病變，最后演變形成胃癌[11]。本研究探討了高原地區CTGF在不同胃黏膜病變中的表達情況，為預防和減少本地區胃癌的發病，探討胃癌發病的病因，尋找最有效的診斷途徑提供了依據。

1 張彥亮，倪海濱.結締組織生長因子與相關疾病的研究進展[J].國外醫學分子生物學分冊,2002,24(3):190-193.

2 Liu LY,Han YC,Wu SH,et al.Expression of connective tissue growth factor in tumor tissues is an independent predictor of poor prognosis in patients with gastric cancer [J].World Journal of Gastroenterology,2008,14(13): 2110-2114.

3 Chang CC,Hsu WH,Wang CC,et al.Connective tissue growth factor activates pluripotency genes and mesenchymal-epithelial transition in head and neck cancer cells[J].Cance Res,2013,73(13):4147-4157.

4 趙慧娟，孫東立，張林霞，等.藥物干預對IgA腎病患者尿液中結締組織生長因子水平的影響及臨床意義[J].中國全科醫學，2010，13(11)：3754.

5 閆慧明，丁利芳，劉媛，等.轉化生長因子-β1與結締組織生長因子在類風濕關節炎合并肺間質病變患者血清中的表達水平及臨床意義[J].中國全科醫學，2012，15(10)：3268.

6 Finger EC,Cheng CF,Williams TR,et al.CTGF is a therapeutic target for metastatic melanoma[J].Onconege,2013,25(5):1038-1042.

7 Wang JG,Ruan J,Li CY,et al.Connective tissue growth factor,a regulator related with 10-hydroxy-2-decenoic acid down-regulate MMPs in rheumatoid arthritis[J].Rheumatol Int，2012,32(9):2791-2799.

8 Sun Z,Yang P,Liang LY,et al.Expression of connective tissue growth factor in colorectal cancer and its association with prognosis[J].Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi,2012,15 (11): 1166-1170.

9 Garcia P,Leal P,Alvarez H,et al.Connective tissue growth factor immunohistochemical expression is associated with gallbladder cancer progression[J].Ach Pathol Lab Med,2013,137(2):245-250.

10 熊元志.重視慢性高原病胃黏膜病變的臨床研究[J].國內講堂,2008,12(10):20-23.

11 王萍,高柳成.胃鏡檢查胃粘膜腸上皮化生相關因素的臨床分析[J].北京醫學,2007,24(12)：753.