非小細(xì)胞肺癌患者血清粒細(xì)胞集落刺激因子水平測定及意義研究

馬若亭，胡春宏，楊 敏

原發(fā)性支氣管肺癌是我國的常見惡性腫瘤之一，在臨床實踐中可以觀察到這樣一種現(xiàn)象：某些非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者在無感染等臨床表現(xiàn)時，出現(xiàn)白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)異常升高的現(xiàn)象，有的甚至出現(xiàn)類白血病反應(yīng)，而在手術(shù)、放化療后白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)下降，這種現(xiàn)象可能與某些細(xì)胞因子的作用有關(guān)。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是細(xì)胞集落刺激因子家族4個亞型(Multi-CSF/IL-3、GM-CSF、M-CSF和G-CSF)之一，是由單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種造血生長因子，能與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，促使中性粒細(xì)胞系造血祖細(xì)胞生長和分化，可特異地調(diào)節(jié)粒系細(xì)胞的增殖和分化，保護(hù)中性粒細(xì)胞免凋亡，并增強成熟粒細(xì)胞的功能，對機體應(yīng)激防御系統(tǒng)有重要意義。但1977年即有第1例報道，發(fā)現(xiàn)肺癌患者粒細(xì)胞增多是由肺癌組織產(chǎn)生G-CSF所引起[1]，許多國外學(xué)者的研究已通過檢測血清G-CSF水平及腫瘤組織G-CSF的表達(dá)證實了腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生G-CSF。本研究采用酶聯(lián)免疫法檢測血清G-CSF水平在NSCLC患者手術(shù)前后的變化，分析血清G-CSF水平與NSCLC的臨床病理因素的關(guān)系，以期對NSCLC的診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后判斷有所幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集經(jīng)病理證實初診初治NSCLC患者50例為研究對象，其中男36例，女14例，男女比例為2.57∶1；年齡30～78歲，平均57歲；腫瘤臨床分期:Ⅰ期29例、Ⅱ期13例、Ⅲ期8例；鱗癌23例、腺癌25例、大細(xì)胞癌2例。排除發(fā)熱、感染、血液病、骨髓轉(zhuǎn)移患者。術(shù)前外周血白細(xì)胞計數(shù)以術(shù)前1周檢查結(jié)果為準(zhǔn)，術(shù)后外周血白細(xì)胞計數(shù)以術(shù)后6～7 d檢查結(jié)果為準(zhǔn)。分別取手術(shù)前后清晨空腹靜脈血5 ml，靜置20 min，3 000 r/min，離心20 min，吸取血清分裝保存在-20 ℃冰箱內(nèi)，待測。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料的收集 依據(jù)住院病歷和病理報告單，記錄患者術(shù)前有無發(fā)熱、手術(shù)前后外周血白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)；腫瘤大小、有無壞死、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)；腫瘤分期、分級；患者的性別、年齡。腫瘤分期根據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)對NSCLC的TNM分期。血清G-CSF參考值為0～18.1 ng/L[2]。

1.2.2 ELISA法測定人G-CSF 分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，向人G-CSF ELISA試劑盒(深圳晶美生物工程公司)加樣。空白孔加樣品稀釋液100 μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μl，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育90 min。分別加入生物素化抗體工作液100 μl，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育60 min。分別加入酶結(jié)合物工作液100 μl，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育30 min。每孔分別加顯色劑100 μl，避光37 ℃孵箱孵育15 min。每孔分別加終止液100 μl，混勻后即刻在450 nm波長(全自動紫外線分光光度計：美國Beckman Du-70)依序測量各孔的光密度(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo))，OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo))，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，即為樣品的實際濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。血清G-CSF水平、白細(xì)胞計數(shù)及粒細(xì)胞計數(shù)采用配對t檢驗，血清G-CSF水平與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系采用獨立樣本t檢驗，G-CSF表達(dá)與腫瘤組織學(xué)類型、臨床分期、腫瘤分化程度之間的關(guān)系采用方差分析，G-CSF表達(dá)與腫瘤大小的關(guān)聯(lián)采用雙變量相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清G-CSF水平手術(shù)前后的變化 術(shù)后NSCLC患者血清G-CSF水平為(15.7±13.4)ng/L，低于術(shù)前的(33.3±30.4)ng/L，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.537，P<0.01)。

2.2 白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)手術(shù)前后的變化 術(shù)后NSCLC患者外周血白細(xì)胞計數(shù)為(6.9±1.5)×109/L、中性粒細(xì)胞計數(shù)為(4.3±1.4)×109/L，均低于術(shù)前患者外周血白細(xì)胞計數(shù)(7.4±1.9)×109/L和中性粒細(xì)胞計數(shù)(4.9±1.8)×109/L，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t白細(xì)胞計數(shù)=1.996，t中性粒細(xì)胞計數(shù)=1.912；均P<0.05)。

2.3 血清G-CSF水平與患者年齡的關(guān)系 年齡<60歲的NSCLC患者術(shù)前血清G-CSF水平為(41.5±29.1)ng/L，≥60歲者為(20.0±18.3)ng/L，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.423，P<0.01)。

2.4 血清G-CSF水平與腫瘤組織學(xué)類型、分化程度及腫瘤大小的關(guān)系

2.4.1 血清G-CSF水平與腫瘤組織學(xué)類型的關(guān)系 大細(xì)胞癌患者的血清G-CSF水平為(137.9±20.4)ng/L、鱗癌患者為(37.5±24.0)ng/L、腺癌患者為(21.0±15.7)ng/L，3者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.20，P<0.01)；且大細(xì)胞癌患者較鱗癌和腺癌患者均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.97，10.00；均P<0.05)，鱗癌患者較腺癌患者高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.25，P<0.05，見圖1)。

2.4.2 血清G-CSF水平與腫瘤分化程度的關(guān)系 腫瘤病理組織學(xué)分級，Ⅰ級高分化5例(10%)，Ⅱ級中分化15例(30%)，Ⅲ級未分化或低分化30例(60%)，其中Ⅲ級患者血清G-CSF水平為(42.8±33.7)ng/L、Ⅱ級為(23.58±17.3)ng/L、Ⅰ級為(5.4±5.4)ng/L，3者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.45，P<0.01)；且Ⅲ級較Ⅰ級和Ⅱ級均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.66，-2.64；均P<0.05)，Ⅱ級較Ⅰ級高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.98，P<0.01，見圖2)。

2.4.3 血清G-CSF水平與腫瘤大小的關(guān)系 50例患者中最大的腫瘤直徑為9 cm，最小為1 cm，中位數(shù)為3.5 cm，血清G-CSF水平的相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清G-CSF水平與腫瘤大小無相關(guān)性(r=0.174，P>0.05)。

2.5 血清G-CSF水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 50例患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的血清G-CSF水平為(45.0±21.3)ng/L，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(26.2.0±23.1)ng/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.654，P<0.01)。

圖1 血清G-CSF水平與腫瘤組織學(xué)類型的關(guān)系

Figure1 Relationship between serum G-CSF level and tumor histologic types

圖2 血清G-CSF水平與腫瘤分化程度的關(guān)系

Figure2 Relationship between serum G-CSF level and the degree of tumor differentiation

3 討論

目前有關(guān)G-CSF對腫瘤細(xì)胞作用機制尚不明確，腫瘤細(xì)胞分泌的G-CSF與腫瘤細(xì)胞的G-CSF受體相結(jié)合，通過自分泌方式促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖、增強了腫瘤的侵襲性、增加了轉(zhuǎn)移可能[3]。G-CSF還通過旁分泌方式作用于腫瘤間質(zhì)，并通過影響、調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)誘導(dǎo)改變微環(huán)境來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。此外G-CSF還被認(rèn)為可以直接或間接發(fā)揮免疫抑制的作用，從而導(dǎo)致該類腫瘤預(yù)后差[4]。

肺癌是可以分泌G-CSF的實體腫瘤中最常見的一種，本研究結(jié)果顯示，術(shù)后血清G-CSF水平低于術(shù)前，手術(shù)前后血清G-CSF水平有差異。國內(nèi)外均有報道發(fā)現(xiàn)NSCLC患者術(shù)后血清G-CSF水平下降[5-7]。可以認(rèn)為，手術(shù)前后血清G-CSF水平有差異與術(shù)后腫瘤負(fù)荷降低、腫瘤細(xì)胞分泌G-CSF減少有關(guān)。本研究也證實白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)在術(shù)后下降，考慮與術(shù)后腫瘤負(fù)荷降低、腫瘤細(xì)胞分泌G-CSF減少有關(guān)，從而引起中性粒細(xì)胞計數(shù)下降。因此，臨床上對伴有G-CSF分泌的NSCLC患者，檢測其外周血中性粒細(xì)胞計數(shù)水平和血清G-CSF水平可作為衡量其病情變化的一個指標(biāo)。

本研究50例血清G-CSF水平測定顯示，G-CSF水平在各組織學(xué)類型之間有差異，血清G-CSF水平與腫瘤組織學(xué)類型密切相關(guān)，大細(xì)胞癌患者血清G-CSF水平顯著高于其他組織學(xué)類型，其次是鱗癌，腺癌最低。此研究結(jié)果與Takaoka等[2]研究結(jié)果一致，Takaoka等發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生G-CSF的肺癌中絕大部分是大細(xì)胞癌和鱗癌。Kasuga等[8]研究中通過免疫組化檢測證實12例分泌G-CSF的肺癌組織細(xì)胞中，有3例是大細(xì)胞癌，4例鱗癌，5例腺癌，其中大細(xì)胞癌免疫組化染色強陽性，較其他組織類型染色更為明顯。血清G-CSF水平與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，血清G-CSF水平高的NSCLC易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與血清G-CSF水平高的NSCLC預(yù)后差、易轉(zhuǎn)移的報道一致[9]。G-CSF增強了腫瘤的侵襲性、增加了轉(zhuǎn)移可能。

通常判定一個腫瘤標(biāo)記物的臨床價值的因素有3個：(1)該腫瘤標(biāo)記物在該腫瘤患者中的檢出率，即敏感度；(2)此腫瘤標(biāo)記物水平與腫瘤負(fù)荷的關(guān)系；(3)此腫瘤標(biāo)記物反映臨床治療療效程度。國外有研究報道G-CSF的靈敏度為66%，高于癌胚抗原(CEA)(62%)和細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)(51%)，有研究顯示，血清G-CSF檢測在以上方面有較好的體現(xiàn)[5]。結(jié)合本研究結(jié)果，G-CSF有可能作為一種新型腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于臨床，其敏感度和特異度可能優(yōu)于目前常用的傳統(tǒng)標(biāo)記物。對于臨床證實伴有血清G-CSF水平增高的腫瘤患者，G-CSF有可能作為診斷、監(jiān)測腫瘤是否復(fù)發(fā)和隨訪的標(biāo)志。

綜上所述，在選擇使用外源性G-CSF治療化療引起的粒細(xì)胞減少癥時應(yīng)慎重，應(yīng)當(dāng)認(rèn)真地重新評估G-CSF對實體腫瘤的促生長作用及用于腫瘤治療的后果。由于目前有關(guān)腫瘤細(xì)胞分泌G-CSF的細(xì)胞和分子生物學(xué)機制尚不明確，還需要進(jìn)一步深入研究，而與G-CSF相關(guān)的分子靶向治療有可能成為治療策略之一。

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