貴州漢族人群載脂蛋白A5-1131T>C及56C>G基因多態性與2型糖尿病的相關性研究

黃 健，黃韻祝，楊國珍，蹇孝麗

血漿三酰甘油(TG)水平升高是2型糖尿病(T2DM)患者血脂代謝異常的主要特征之一[1-2]。研究表明，人類載脂蛋白A5(ApoA5)基因的單核苷酸突變(SNPs)對人群的TG水平有顯著影響，其中ApoA5-1131T>C及56C>G兩個位點基因多態性對血漿TG水平的影響較大[3]。由于基因多態性分布存在種族差異，因此本研究對貴州漢族健康人群及T2DM患者進行ApoA5基因多態性研究，探討基因多態性與T2DM的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年3月—2013年3月貴陽醫學院附屬醫院收治的無親緣關系的T2DM患者192例為T2DM組，其中男88例，女104例；平均年齡(58.2±10.3)歲，均符合世界衛生組織(WHO)1999年糖尿病診斷標準。另選擇同時期我院體檢中心體檢血脂及血糖正常者206例為對照組，其中男82例，女124例；平均年齡(58.8±9.2)歲。排除標準：急性炎癥，風濕免疫疾病，惡性腫瘤，心腦血管、肝、腎疾病，甲狀腺疾病。兩組均為貴州地區漢族人群，年齡、性別間有均衡性。

1.2 研究方法

1.2.1 血脂及血糖水平檢測 采用生化管抽取受試者清晨空腹外周血5 ml，離心半徑13.5 cm，3 000 r/min離心5 min,取上層血清使用奧林巴斯5400全自動生化分析儀測定TG、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及血糖水平。

1.2.2 外周血基因組DNA提取 抽取外周靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝用于提取基因組DNA。按亞能生物技術有限公司DNA提取試劑盒說明書抽提基因組DNA。取5 μl基因組DNA與1 μl 6×loading buffer點樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，90 V電壓電泳60 min。在凝膠成像儀上觀察所提取的基因組DNA的亮度及純度(此試劑盒提取的DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳有一條清晰的約20 kbp的DNA條帶)。

1.2.3 ApoA5-1131T>C、56C>G位點的限制性片段長度多態性(RFLP)分析 (1) 聚合酶鏈反應(PCR)擴增：引物設計參考相關文獻[4]設計如下：-1131T>C位點上游5′GGAGCTTGTGAACGTGTGTATGAGT 3′,下游5′CCCCAGGAACTGGAGCGAAATT 3′。56C>G位點上游5′GGCTCTTCTTTCAGGTGGGTCTCCG 3′，下游5′GCCTTTCCGTGCCTGGGTGGT 3′。由寶生物工程有限公司合成。PCR擴增反應體系(25 μl)：包括Premix Taq 12.5 μl，模板DNA 3 μl，上下引物各0.3 μl，雙蒸水補足體積。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環，最后72 ℃延伸7 min。PCR產物5 μl用2%的瓊脂糖凝膠中電泳(90 V 40 min)，在凝膠成像儀上觀察并攝像，結合DNA Marker判斷是否為目的DNA。(2) ApoA5-1131T>C位點PCR產物酶切：取出現清晰的特異性條帶PCR產物，以MseⅠ限制性內切酶進行消化(37 ℃水浴4 h)。酶切反應體系如下(20 μl)：10×Buffer 2 μl，牛血清清蛋白(BSA)0.2 μl，MseⅠ0.5 μl，PCR產物8 μl，雙蒸水補足體積。酶切產物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，80 V電壓電泳2 h，在凝膠成像儀上觀察并攝像。(3) 56C>G位點PCR產物酶切：取出現清晰的特異性條帶PCR產物，以TaqⅠ限制性內切酶進行消化(65 ℃水浴2 h)。酶切反應體系如下(10 μl)：10×Buffer 1 μl，BSA 1 μl，TaqⅠ0.5 μl，PCR產物8 μl，雙蒸水補足體積。酶切產物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，80 V電壓電泳2 h，在凝膠成像儀上觀察并攝像。

2 結果

2.1 ApoA5-1131T>C、56C>G位點PCR酶切產物電泳結果 -1131T>C位點位于ApoA5基因啟動子區域，酶切產物電泳后可出現3種情況：133 bp和21 bp兩條帶的為TT野生型純合子；只有154 bp一條帶的為CC突變型純合子；有154 bp、133 bp和21 bp三條帶的為TC型雜合子(見圖1)。

56C>G位點酶切產物有三種基因型：134 bp和23 bp兩條帶的為CC野生型純合子；只有157 bp一條帶的為GG突變型純合子；有157 bp、134 bp和23 bp三條帶的為CG型雜合子(見圖2)。

2.2 對照組與T2DM組ApoA5-1131T>C基因型和等位基因頻率分布比較 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，對照組(χ2=0.477，P=0.489)、T2DM組(χ2=1.597，P=0.206)ApoA5-1131T>C基因型分布均符合遺傳平衡定律，具有群體代表性。兩組的基因型和等位基因頻率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；相對風險顯示攜帶TC+CC基因型者患T2DM的風險是TT基因型的1.965倍(見表1)。

2.3 對照組及T2DM組ApoA5-1131T>C位點不同基因型者血脂水平比較 對照組TC+CC基因型攜帶者TG水平高于TT基因型攜帶者，差異有統計學意義(P<0.05)；T2DM組TC+CC基因型攜帶者TG水平高于TT基因型攜帶者，差異有統計學意義(P<0.05)；而對照組和T2DM組TC+CC基因型攜帶者與TT基因型攜帶者TC、LDL、HDL水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表2、3)。

圖1 ApoA5-1131T>C位點限制性片段長度多態性分析

Figure1 Genotyping of the T>C polymorphism at nucleotide -1131 of the ApoA5 gene by PCR-RFLP

2.4 ApoA5 56C>G位點基因型及等位基因頻率分布情況分析 ApoA5 56C>G位點位于ApoA5基因第二外顯子，PCR產物長度157 bp。僅檢測出CC一種基因型，沒有發現其他基因型，無法進行統計學分析，也無法分析這一位點與T2DM及血脂的關系，因此未做進一步的探討。

圖2 ApoA556C>G位點限制性片段長度多態性分析

Figure2 Genotyping of the C>G polymorphism at nucleotide 56 of the ApoA5 gene by PCR-RFLP

表1 對照組與T2DM組ApoA5-1131T>C基因型和等位基因頻率分布比較〔n(%)〕

Table1 Comparison of distributions of ApoA5-1131T>C genotype and allele between control group and T2DM group

組別例數基因型TT TC CC等位基因T C對照組206108(524)85(413)13(63)301(731)111(269)T2DM組19269(359)99(516)24(125)237(617)147(383)χ2值1245211666P值 0002 0001 OR值 1965 1682 95%CI(1314，2937)(1247，2269)

Table2 Comparison of lipoprotein levels in ApoA5-1131T>C defferent genotype in control group

基因型例數TGTCLDLHDLTT108156±054468±101304±070128±025TC+CC 98 184±087452±124313±065135±030t值-26851064-0870-1911P值 00080289 0386 0058

注：TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL=低密度脂蛋白，HDL=高密度脂蛋白

Table3 Comparison of lipoprotein levels in ApoA5-1131T>C defferent genotype in T2DM group

基因型例數TGTCLDLHDLTT 69 164±058419±118248±085115±031TC+CC123231±145446±128256±085107±029t值-4472-1516-06131841P值 0000 0132 05410067

3 討論

糖尿病是目前世界范圍內繼腫瘤、心腦血管病后的第三位嚴重危害人類健康的慢性疾病。糖尿病患者脂代謝紊亂一直是人們關注的重點,其重要作用越來越受到人們的重視[5]。ApoA5基因是新近發現的一個載脂蛋白基因，研究表明，人類ApoA5基因的SNPs對人群的TG水平有顯著影響，而ApoA5調節TG的作用機制目前仍在研究當中[6-7]。很多患者在糖代謝異常之前就已經出現了脂代謝異常，血TG水平升高是其常見特點。Sane等[8]對6個家族性高三酰甘油血癥(HTG)家系患者進行追蹤，發現這類家系中T2DM的發病率明顯增加，認為空腹血TG水平增高是發生T2DM的獨立預測指標。Chiu等[9]發現，ApoA5基因多態性對胰島β細胞功能可構成影響，從而影響血糖的調節，其作用機制可能為：ApoA5與肝素結合細胞因子(midkine)相關聯，進而促進胰島β細胞對胰島素的分泌。

本研究發現T2DM組的TC基因型頻率高于對照組，-1131C等位基因攜帶者(TC+CC)的TG水平高于未攜帶者(TT)，C等位基因攜帶者(TC、CC)的TG水平高于未攜帶者(TT),此結果與國內的一些研究結果相似[10]。但肖輝等[11]對ApoA5-1131T>C基因多態性與維吾爾族T2DM的關聯研究發現，ApoA5-1131C基因多態性與新疆維吾爾族的T2DM的發生并不具有相關性，可能因研究對象的差異及不同地區人群的遺傳背景不同所致。要揭示其更加具體的關系尚有待更大樣本量的臨床研究以及基礎研究。對ApoA5-1131T>C基因多態性的研究發現，不同種族人群的-1131C等位基因頻率有差異。本研究顯示貴州地區漢族人群的ApoA5基因-1131C等位基因頻率與亞洲人相似，高于白種人，這與國內的一些研究結果相似[12-13]。說明C等位基因在亞洲人群中更為常見，提示該基因的變異對血TG水平的影響在亞洲人中可能更值得注意。ApoA5-1131T>C位點在不同種族人群當中可以不同程度地影響人血漿TG水平，而對TC、LDL-C、HDL-C等的影響卻沒有統一的認識，原因或許是由于遺傳背景、觀察手段、樣本特征等這些因素造成的。

在進行ApoA5 56C>G基因多態性研究中，只檢測出CC一種基因型，所以無法建立血脂水平與這個位點之間的關系。其可能原因是由于遺傳背景的差異使得中國人血脂變化對其不敏感，或是因為樣本數量不夠大導致應該存在的差異未顯露出來。丁妍等[14]在對257名湖北省漢族人群56C>G位點研究中

得出G等位基因頻率小于1%，其認為ApoA5基因 56C>G是一個突變點而不是一個多態位點。而Huback等[15]研究發現這個位點的突變不僅使TG水平升高，還增加了患急性心肌梗死的風險。這說明在不同人種之間遺傳背景差異很大。因此研究不同民族之間的這種差異，有助于解釋不同人群和個體對疾病的易患性。由于本次實驗的樣本量較少，這個位點到底是突變點還是多態位點需要加大樣本量再做進一步的證實。

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7 魏紅霞,陳娟,李雷,等.葡萄糖對鼠原代肝癌細胞中載脂蛋白A5基因表達的影響[J].中華實驗外科雜志,2013,30(7):1430-1430.

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10 翟光華,聞平,郭蘭芳,等.型糖尿病患者 APOA5-1131T/C 基因多態性與血脂代謝和胰島素抵抗的關系研究[J].遺傳,2007,29(5): 541-546.

11 肖輝,張月明,李涵秋,等.ApoA5-1131T>C基因多態性與維吾爾族2型糖尿病的關聯研究[J].現代預防醫學,2010,37(4):722-724.

12 李海新.2型糖尿病腎病患者ApoA5-1131T/C基因多態性與脂蛋白a水平相關性研究[J].現代檢驗醫學雜志,2010,25(6):92-93.

13 彭茜,廖蘊華,霍冬梅,等.廣西京族人群載脂蛋白A5-1131T>C基因多態性與血脂的關系[J].廣東醫學,2013,34(6):857-860.

14 丁妍,朱名安,周有利,等.湖北漢族人群載脂蛋白A5遺傳多態性分析[J].遺傳，2007,29(5):554-558.

15 Huback JA,Skodova Z,Adamkova V,et al.The influence of APOAV polymorphisms(T-1131>C and S19>W) on plasma triglyceride levels and risk of myocardial infarction[J].Clin Genet,2004,65(2):126-130.