金匱腎氣丸對恐傷腎模型仔鼠多巴胺水平的調節作用研究

王紅艷，張先庚，劉 琴，梁小利，彭德忠

《素問·舉痛論》云：“余知百病生于氣也，恐則氣下，恐則精卻，卻則上焦閉，閉則氣還，還則下焦脹，故氣下行矣”[1]。恐為腎志，恐則氣下，恐則精卻，過度恐懼可致腎精虧虛。本實驗根據恐傷腎的中醫病因病機理論，用模擬地震恐嚇孕鼠[2]，傷其腎精，造成孕鼠腎精虧虛，并給予金匱腎氣丸進行干預，以此研究金匱腎氣丸對孕鼠產仔數量及仔鼠出生體質量、多巴胺水平的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠72只，其中雌性48只，雄性24只；體質量224.5～260.5 g，均無生育史。由成都達碩生物科技有限公司〔生產合格證號：SCXK(川)2008-24〕 提供。實驗前置SD大鼠于室溫內適應環境1周，室溫20～22 ℃，濕度50%～60%。飼料由成都達碩生物科技有限公司〔生產許可證號SCXK(川)2010-01〕 提供。

1.1.2 藥物 金匱腎氣丸：由中藥地黃、山藥、山茱萸(酒炙)、茯苓、牡丹皮、澤瀉、桂子、附子(炙)、牛膝(去頭)、車前子(鹽炙)組成，北京同仁堂科技發展股份有限公司生產，批號8030876。

1.1.3 儀器與試劑 地震測速器(由成都高新減災研究所研制，成都市美幻科技有限公司生產)、Multiskan MK3型酶標儀(美國Thermo Electron Corporation，編號：BKY-ZX-014)、LD5-10B型低速離心機(北京醫用離心機廠，編號：BKY-ZX-0162)、天平秤、多巴胺(201112,dze30326)試劑盒(生產公司：R&D Systems China Co.Ltd)、微量加液器、吸頭、EP管，眼科剪等手術器械。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 按雌∶雄2∶1比例隨機配對交配，次日清晨發現陰栓者為妊娠，當天作為受孕的第1天，發現妊娠后分籠飼養。將34只初次受孕孕鼠采用隨機數字表法分為對照組11只，體質量(234.9±2.2)g；地震組11只，體質量(235.0±2.0)g；中藥組12只，體質量(235.2±2.0)g。3組體質量比較，差異無統計學意義(F=0.186，P=0.767)。

1.2.2 實驗方法 將3組孕鼠放置于標準鼠籠中飼養，從孕期第1天開始給予相同的飲水(自來水)和光照。地震組和中藥組模擬地震震動2次/d，15～20 min/次。利用地震測速器測定數據如下：烈度:9.6～10.5,三軸合成峰值加速度:1 350～1 400 mg,水平合成峰值加速度:1 000～1 050 mg，東西向峰值加速度:850～900 mg,南北向峰值加速度:1 050～1 100 mg,垂直向峰值加速度:800～850 mg。中藥組用藥量按成人公斤體質量用量的10倍進行折算(根據成人體質量50～60 kg，每日服用約10 g，折算出250～300 g體質量的大鼠服用量為0.5～0.6 g/d)，將中藥金匱腎氣丸研碎后混入常規飼料中喂養。地震組和對照組喂養普通飼料。模擬地震刺激及中藥飼料喂養持續干預至孕期第19天后停止，將每只孕鼠單獨放置于標準孕鼠盒飼養，待產仔后各組按統一方法飼養，停止干預措施。

1.2.3 觀察指標及測定 觀察恐傷孕鼠死亡率、產仔率、產仔數量及仔鼠出生體質量，飼養至25 d，仔鼠部分死亡，對照組存活35只、地震組24只、中藥組34只，測量仔鼠的行為能力(亮盒排便實驗)。同時在各組隨機抽取10只，共30只仔鼠，從股動脈采全血2 ml，全血標本于室溫放置10～20 min凝固分層后，離心半徑15 cm，2 000～3 000 r/min,離心20 min，收集上清液。采用酶聯免疫吸附試驗法檢測多巴胺水平，按說明書操作，Multiskan MK3型酶標儀檢測吸光度，吸光度的檢測波長為 450 nm。

2 結果

2.1 3組孕鼠死亡率、產仔率及產仔數量比較 地震組死亡3只，對照組和中藥組均無死亡孕鼠。3組產仔率比較差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 3組仔鼠產仔率比較

2.2 3組仔鼠出生體質量比較 對照組共產鼠65只，地震組共產鼠38只，中藥組共產鼠68只。3組仔鼠出生體質量比較差異有統計學意義(P<0.05)；其中地震組仔鼠出生體質量較對照組和中藥組降低，中藥組較對照組降低，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 3組仔鼠出生體質量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與地震組比較，△P<0.05

2.3 金匱腎氣丸對仔鼠行為能力的影響 3組仔鼠亮盒排便陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)；其中地震組亮盒排便陽性率較對照組和中藥組升高，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表3 3組仔鼠亮盒排便陽性率比較〔n(%)〕

注：與地震組比較，*P<0.05

2.4 金匱腎氣丸對仔鼠多巴胺水平的影響 3組仔鼠多巴胺水平比較差異有統計學意義(P<0.05)；其中地震組仔鼠多巴胺水平較對照組和中藥組降低，差異均有統計學意義(P<0.05，見表4)。

表4 3組仔鼠多巴胺水平比較

注：△采用秩和檢驗；與地震組比較，*P<0.05

3 討論

腎主生殖，恐傷腎陽，傷及沖任，動搖了雌鼠受孕的基礎，腎虛直接影響孕育。此為，恐傷腎精腎氣，恐則氣下，母代氣機失調，腎氣不致，難于安合成孕，難于聚氣成胎，難于聚精養胎。生殖功能自然受到嚴重的影響，甚至喪失生殖能力。本研究中地震組孕鼠產仔數量較中藥組減少，說明其生殖功能減退。

中醫認為，先天腎精(包括父母天癸)是胚胎發育的遺傳物質基礎，可以促進個體的生長發育[3]；母代腎氣虧虛，子代肌骨筋肉生長所需的營養物質供應不足，導致其出生體質量降低。《素問·奇病論》中說“人生而有癲疾者，病名為胎病，此得之在母腹中時，其母有所大驚，氣上而不下，精氣并居，故令子發為癲疾也”。系指孕婦妊娠期間由于驚恐所致的氣機逆亂，會影響胎兒的健康發育。本研究結果顯示，地震組仔鼠出生體質量較對照組低。

亮盒排便是行為遺傳學上的一個經典實驗，它用二便粒次作為衡量動物情緒遺傳力大小的指標，也可以作為中醫“恐傷腎”、“恐則氣下”的客觀指標之一[4]。《醫學入門·臟腑》說：“腎有二枚……納氣，收血，化精，為封藏之本”。《素問·金匱真言論》說：“腎……開竅于二陰”，故腎司前后二陰，為封藏之本，“恐傷腎”，封藏失職，二陰失約，而二便排泄次數增多。地震組仔鼠在亮盒排便測試中，陽性率明顯高于對照組和中藥組。近年來，無論是動物實驗還是人類試驗均已證明，孕期心理應激不僅對胎兒神經系統、生長發育(體質量、身長等)產生影響[5-6]，而且造成子代的遠期功能損害，甚至與某些生理解剖缺陷相關聯[7]。

有人把《婦人大全良方》的胎教思想歸納為5方面進行分析，其中第一是孕婦情緒與胎教，可見情緒對孕婦的重要性[8]。多巴胺是大腦分泌的一種神經遞質，主要參與情感、運動、認知、攝食、正性強化等多種行為過程，多巴胺通過其相應的膜受體發揮作用。D1受體(D1R)主要與空間學習能力有關，D2受體(D2R)功能受損將引起運動減少,協調、空間識別和短期記憶能力下降[9-10]。本研究發現地震組多巴胺水平低于其他兩組，提示地震恐懼可降低多巴胺水平，而多巴胺水平的降低可引發抑郁、恐懼等情志障礙，如張春虎等[11]發現慢性應激大鼠的多巴胺水平明顯低于空白對照組。補腎中藥治療后多巴胺水平可恢復正常,提示金匱腎氣丸可能有恢復多巴胺的合成以及代謝功能。

金匱腎氣丸來源于漢代張仲景所著的《金匱要略》一書，其作用為溫補腎陽，調節腎的生理功能。基于“恐傷腎”和“補腎”的理論基礎，本研究采用補腎中藥金匱腎氣丸來調護地震恐懼對孕鼠的損害，結果提高了孕鼠的產仔數、增加了仔鼠出生體質量，提高了仔鼠的行為能力，說明該方可有效糾正地震恐懼對母鼠造成的“腎不藏精”、“腎氣虛衰”等不良影響，使仔鼠生長發育遲緩、體質量降低等不良癥狀得到改善。同時有效地提高恐懼應激下仔鼠血漿多巴胺水平，表明該方對孕鼠恐傷腎病理變化有防治作用。說明補腎法及其方藥具有良好的抗恐懼應激損傷作用。本研究亦為進一步研究中醫學腎臟與恐懼心理應激的關系提供了一定的實驗依據，對中醫恐傷腎理論的研究具有良好的理論價值。

1 孫廣仁.中醫基礎理論[M].北京:中國中醫藥出版社,2007:96-98.

2 劉琴,張先庚,梁清芳,等.從SD大鼠子代的體重與身長論證優裕“胎教”和地震“胎損”環境的造模[J].遼寧中醫藥大學學報,2012,14(1):88-90.

3 張登本.中醫學基礎[M].北京:中國中醫藥出版社,2007:47.

4 王米渠,吳斌,馮韌.“恐傷腎”母子兩代的勝利研究[J].福建中醫藥,2003,34(1):3-4.

5 Lee W,Balasubramaniam M，Deter RL,et al.Fetal growth parameters and birth weight:their relationship to neonatal body composition[J].Ultrasound Obstet Gynecol，2009，33(4):441-446.

6 Vaag A.Low birth weight and early weight gain in the metabolic syndrome:consequences for infant nutrition[J].Int J Gynaecol Obstet,2009,104 (Suppl 1):S32-S34.

7 范粉靈,岳亞飛.孕期心理應激對其子代的影響[J].國外醫學婦幼保健分冊，2005,16(1):21-23.

8 張越平,阮氏水.從《婦人大全良方-胎教門》看中醫胎教學[J].天津中醫藥,2012,29(6):606-607.

9 劉莉莉.SKF-81297對ADHD動物模型SHR大鼠行為及其影響機制的研究[D].濟南：山東大學,2008.

10 胡家慶,殷明,章建程,等.心理應激對大鼠多巴胺受體功能的影響及酪氨酸的干預作用[J].解放軍醫學雜志，2006,31(1):187-189.

11 張春虎,胡隨瑜,陳昌華.白松片對應激大鼠行為及額葉皮質羥色胺、多巴胺的影響[J].中國行為醫學科學,2004,13(2):127-128.