5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態性與原因不明復發性流產關聯的Meta分析

劉宇巖，楊博逸，李永芳，盧響響，王 達，孫貴范

復發性流產(recurrent spontaneous abortion,RSA)即自然流產連續發生兩次或兩次以上，其病因極其復雜，常見的有胚胎染色體異常，子宮畸形或宮腔粘連等解剖異常，黃體功能不足或甲狀腺功能低下等內分泌異常，支原體、衣原體、弓形蟲、巨細胞病毒等感染因素，以及抗磷脂抗體、抗核抗體、抗精子抗體陽性等自身免疫功能紊亂等[1]。然而臨床上排除了以上因素后，仍有近1/2的患者病因不明，故稱為原因不明復發性流產(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)。已有研究發現，RSA的發生率在整個孕齡婦女群體中占1%～2%，而其中約有50%為URSA[2]。造成URSA的主要病因之一即為母體內編碼5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的基因677位點發生突變(677C→T)。該基因位點的突變可直接導致MTHFR的酶活性下降，進而引發機體內同型半胱氨酸水平的升高[3-4]。已有研究證實同型半胱氨酸水平升高可破壞機體凝血與纖溶之間的平衡，使機體處于血栓前狀態。由其所致的胎盤動脈栓塞可進一步引發胚胎供血不足、絨毛壞死等不良結果，而這些都是導致自然流產發生的重要原因[5]。截至目前，國內外已進行了大量關于MTHFR C677T基因突變與URSA之間的關聯的研究，但其所得到的研究結果之間卻存在很大差異。因此，本研究主要通過對1997—2011年發表共22篇文獻(9篇關于中國人群的研究，13篇關于除中國外其他12個國家的研究)進行分析，進而對母體MTHFR C677T基因多態性與URSA之間的關聯進行一次宏觀評價。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所納入的文獻必須為針對MTHFR C677T基因多態性與URSA的患者和健康人群進行的病例對照研究。

1.1.1 納入標準 (1)研究中所包含的URSA患者與健康個體均來自統一總體，年齡、民族、生活習慣等基本資料均嚴格匹配，均衡可比；(2)入選文獻中必須明確URSA的定義(如注明流產次數和發生的時間)，WHO于2009年明確了RSA的次數，即兩次或兩次以上的流產[6]，因此本Meta分析所納入的URSA人群應為在排除其他臨床上可查的致流產因素后連續自然流產兩次或兩次以上的流產個體；(3)入選文獻中還需分別列出病例組和對照組中各基因型(即CC、CT、TT)個體的數量，或者可通過給出的各基因型頻率計算出相應人數。其中對照組中MTHFR C677T各基因型頻率分布應符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

1.1.2 排除標準 (1)文獻中未注明樣本人群諸如年齡、民族、生活習慣等一般信息者；(2)文獻研究中未明確URSA定義者；(3)文獻中未列出各基因型頻數或頻率者。

1.2 文獻檢索 在檢索過程中，我們并未對文獻語種加以限制，因此同時利用Pubmed數據庫和中國知網(CNKI)以及萬方數據庫進行檢索，前者主要用于檢索國外發表的英文文獻，而后兩者則用于檢索中文相關文獻。在Pubmed中，我們利用下列關鍵詞對相關文獻進行檢索：〔mthfr OR methylenetetrahydrofolate reductase(MeSH Terms)〕 AND 〔abortion(MeSH Terms) OR miscarriage(MeSH Terms)OR fetal loss OR pregnancy loss〕。在CNKI和萬方數據庫中則鍵入“MTHFR”(或“5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶”)和“流產”搜索相關中文文獻。

1.3 文獻篩檢與數據提取 嚴格按照上述標準對從各數據庫中檢索出的相關文獻進行了篩選，同時采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)量表對篩選后所有入選文獻進行質量評價，包括病例的定義是否充分、病例的代表性、對照的選擇、對照的定義及可比性，評價標準滿分為9分。從每篇入選文獻中提取了文獻作者、發表年限、病例組和對照組中分別所包含的研究對象的個數外，對開展研究所在的國家、病例組中個體的流產次數和發生時間以及研究對象的入選標準等信息也進行了提取，因此有助于解釋各獨立研究結果之間的異質性。

1.4 統計學方法 首先以OR值及其95%CI來分別表示各入選文獻中記載的URSA與MTHFR基因突變之間的關聯強度，即在URSA病例組與健康對照組之間分別以突變純合型(TT)個體數與野生型(CC)個體數、突變雜合型(CT)個體數與野生型(CC)個體數、T等位基因攜帶者(TT+CT)個體數與野生型(CC)個體數、突變純合型(TT)個體數與C等位基因攜帶者(CT+CC)個體數以及T等位基因頻數與C等位基因頻數計算OR值及其95%CI。然后，再以固定效應模型或隨機效應模型對上述OR值進行加權合并計算出最后的合并OR值和95%CI。在異質性檢驗中，我們主要利用Q檢驗對各獨立研究結果進行異質性檢驗：若P<0.05,則說明差異有統計學意義，此時應改用隨機效應模型進行合并。除此之外，我們還可通過I2值對異質性的大小進行評價，I2值的取值范圍在0%～100%之間，當I2值為0%代表各獨立研究結果間無異質性，各研究結果間的異質性越大，則I2值也隨之增大[7]。本次研究中我們還進行了按不同種族和地區分層分析，這樣不僅可以降低各獨立研究間的異質性，而且還可對中國人群進行重點分析。我們利用Begg等[8]提出的秩相關檢驗及Egger等[9]提出的線性回歸法對本次研究中存在的發表偏倚進行評價。之所以沒有單一通過肉眼觀察漏斗圖的方式對發表偏倚進行評價是因為各獨立研究的方法學質量參差不齊，即存在異質性也是導致漏斗圖不對稱的原因之一，因此也就無法對發表偏倚做出合理評價[10]。本次研究中的所有統計分析均采用Stata 11.0軟件實現。

2 結果

2.1 檢索結果 首次檢索共檢出94篇相關文獻(中文26篇，英文68篇)。對此94篇相關文獻進一步篩選，其中有30篇文獻(中文6篇，英文24篇)并未涉及母體MTHFR C677T突變與URSA之間的關聯或未進行相關的病例對照研究。在余下的64篇文獻中，有英文文獻23篇未具體注明病例組和對照組中各基因型人數，予以剔除。此外，還有2篇未注明流產次數(中文1篇，英文1篇)的文獻[11-12]和1篇定義流產次數為大于等于一次的英文文獻[13]，為盡量縮小本次研究中各獨立研究之間的異質性，且嚴格遵循URSA的定義，決定予以剔除。在進一步剔除了15篇(中文10篇，英文5篇)完全重復的或僅所包含數據重復的文獻(對于后者我們選取對研究對象特征描述相對全面，相關數據分析更為細致的文獻納入研究)后，我們得到了23篇符合標準的文獻(中文9篇，英文14篇)[14-36]。最后，對該23篇符合標準文獻中對照組基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，除文獻[36]外，其他所有22篇文獻中對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，并最終納入本次Meta分析中(見表1)。

表1 所有入選文獻相關信息

2.2 納入文獻方法學質量評價結果 所納入的22篇文獻文獻均符合之前制定的篩選標準,且NOS量表得分均為9分。

2.3 Meta分析結果

2.3.1 整體分析結果 所有22篇文獻中共包括URSA患者2 198人，正常對照2 612人。在對各文獻中TT與CC、CT與CC、TT+CT與CC以及等位基因T與C之間的OR值進行統計合并，異質性檢驗發現上述4組數據中各獨立研究之間均存在異質性(P<0.05)，因此采用隨機效應模型(即DerSimonian and Laird Method)進行合并分析。分析結果顯示，基因型為TT和CT的女性其發生URSA的風險較基因型為CC者分別高93%和22%，即OR值分別為1.93〔95%CI(1.39,2.68)〕 (見圖1)、1.22〔95%CI(0.99,1.50)〕；基因型為TT或CT的女性其發生URSA的風險較基因型為CC者高36%，即OR值為1.36〔95%CI(1.10,1.67)〕(見圖2)；T等位基因攜帶者發生URSA的風險較C等位基因攜帶者高34%，即OR值為1.34〔95%CI(1.14,1.58)〕(見圖3)。Begg秩相關檢驗(P=0.236)及Egger線性回歸法(P=0.111)的檢驗結果均顯示本次研究中無發表偏倚存在。

2.3.2 按種族地區分層分析 我們還分別對關于中國人群的9篇文獻和針對除中國外其他國家人群13篇文獻中的數據進行了統計分析。所有9篇有關中國人群的文獻中共包括URSA患者892人，正常對照930人。總TT基因型頻率在正常對照組中為12.58%(117/930)，總T等位基因頻率為 34.09%(634/1 860)。在對各文獻中TT與CC、CT與CC、TT+CT與CC以及等位基因T與C之間的OR值進行統計合并，異質性檢驗并未發現上述4組數據中的各獨立研究之間存在異質性(P值分別為0.924、0.164、0.703、0.948)，因此采用固定效應模型(即Mantel and Haenszel Method)進行合并分析。分析結果顯示，基因型為TT和CT的女性其發生URSA的風險較基因型為CC者分別高267%和62%，即OR值分別為3.67〔95%CI(2.68，5.03)〕(見圖4)、1.62〔95%CI(1.29，2.05)〕；基因型為TT或CT的女性其發生URSA的風險較基因型為CC者高105%，即OR值為2.05〔95%CI(1.65，2.55)〕(見圖5)；T等位基因攜帶者發生URSA的風險較C等位基因攜帶者高89%，即OR值為1.89〔95%CI(1.64，2.18)〕(見圖6)。Begg秩相關檢驗(P=0.917)及Egger線性回歸法(P=0.517)的檢驗結果均顯示本次研究中無發表偏倚存在。

注：MTHFR=5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶，URSA=原因不明復發性流產

圖1 MTHFR基因型TT與URSA發生Meta分析森林圖

Figure1 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT genotype of MTHFR

圖2 MTHFR基因型TT+CT與URSA發生Meta分析森林圖

Figure2 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT or CT genotype of MTHFR

圖3 MTHFR基因型T等位基因與URSA發生Meta分析森林圖

Figure3 The forest plot of the relationship between the URSA and the T allele of MTHFR

圖4 中國人群MTHFR基因型TT與URSA發生Meta分析森林圖

Figure4 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT genotype of MTHFR among Chinese people

圖5 中國人群MTHFR基因型TT+CT與URSA發生Meta分析森林圖

Figure5 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT or CT genotype of MTHFR among Chinese people

圖6 中國人群MTHFR基因型T等位基因與URSA發生Meta分析森林圖

Figure6 The forest plot of the relationship between the URSA and the T allele of MTHFR among Chinese people

所有13篇來自除中國以外的其他國家的文獻中共包括URSA患者1 306人，正常對照1 682人。在對各文獻中TT與CC、CT與CC、TT+CT與CC以及等位基因T與C之間的OR值進行統計合并，異質性檢驗發現上述四組數據中除等位基因T與C之間比較外，其余三組數據中的各獨立研究之間均不存在異質性(P值分別為0.081、0.089、0.052、0.023)。然而，合并結果顯示各基因型的分布在URSA組和正常對照組之間的差異均無統計學意義(P>0.05)，即MTHFR C677T突變與URSA發病之間并無關聯。Begg秩相關檢驗(P=0.246)的檢驗結果顯示本次研究中無發表偏倚存在，而Egger線性回歸法(P=0.150)的檢驗結果則顯示存在發表偏倚。

3 討論

MTHFR基因位于染色體1q36.3，目前已發現人類MTHFR有15種點突變類型，其中最重要的是第五個外顯子上677位點發生突變，即C677T突變。該位點C等位基因突變為T等位基因，使原編碼丙氨酸(Ala)突變為纈氨酸(Val)，進而可影響酶的熱敏感性，以及導致酶活性的下降，進而導致了5-甲基四氫葉酸濃度降低，血漿中同型半胱氨酸增高[3-4]。血漿中同型半胱氨酸增高可產生大量的過氧化物和氧自由基，進而抑制血管內皮細胞一氧化氮的合成和釋放導致血管功能異常和內皮細胞受損。高同型半胱氨酸水平還可激活凝血因子XII和V，降低抗凝血因子III、IV的活性，抑制和干擾內皮細胞對硫酸肝素的合成，明顯減弱其抗凝作用，使血小板功能受損和血栓素A2(TXA2)產生增加，破壞機體凝血與纖溶之間的平衡，使機體處于血栓前狀態，加速了動脈粥樣硬化和動脈血栓的形成。如果胎盤動脈出現栓塞，則可引發胚胎供血不足、絨毛壞死，進而造成自然流產的發生[37]。

Ren 等[38]曾于2006年對1997—2005年發表的關于MTHFR C677T突變與URSA之間的關聯的21篇英文文獻和5篇中文文獻進行過一次Meta分析，并得出結論MTHFR C677T基因突變僅在中國人群中才與URSA發病相關，而在其他種族和地區人群中與該疾病的發生并無關聯。然而，該Meta分析所囊括的中文文獻數量較少，也未針對中文文獻制定相關檢索策略，因此本次研究中所包括的中文文獻數量達到9篇之多，旨在重點而且更為系統地針對中國人群中的MTHFR C677T突變與URSA發生之間的關聯程度進行評價。

我們在對全部22篇文獻進行統計合并后所得結果顯示，MTHFR C677T突變與URSA發病之間存在關聯，然而在除中國以外的其他國家中并未發現MTHFR C677T基因突變與URSA發病之間存在關聯。由此可見，全部22篇文獻進行統計合并后得到MTHFR C677T突變與URSA發病之間存在關聯的結果主要是由其中的9篇中文文獻引起的。相關研究曾發現MTHFR C677T基因型的分布在不同國家，同一國家的不同地區，同一地區的不同種族中的分布有差異，其中亞洲人群中T等位基因頻率為2.5%～33%[39]，歐洲人群中T等位基因頻率最高(24%～40%)[40]，非洲最低(4.9%～9.1%)[39]。在本次Meta分析所包含的9篇中文文獻中，總TT基因型頻率在正常對照組中為12.58%，總T等位基因頻率為 34.09%，因此從本次研究所得數據可以看出中國健康女性人群中T等位基因攜帶者的比例明顯高于總體亞洲人群的范圍，故除了URSA外，還應在中國女性人群中積極預防新生兒神經管畸形，妊娠高血壓綜合征等其他與MTHFR C677T點突變相關的疾病。

URSA的發病還與體內葉酸水平降低有關[41]，其水平下降直接導致體內甲基供體，即5-甲基四氫葉酸的不足，進而引發同型半胱氨酸水平的升高。盡管近年來中國廣泛實施對圍孕期婦女增補葉酸的政策，但由于人口基數大、地理位置偏遠以及飲食習慣和文化水平差異等因素的影響，很多地區尤其是北方婦女體內葉酸仍然嚴重缺乏，因此葉酸補給不足也可導致URSA的發生，即成為MTHFR C677T基因多態性與URSA之間關聯的一個混雜因素。賀憲民等[42]曾對中國南方和北方女性的MTHFR C677T各基因型的頻率進行統計發現，TT基因型在北方和南方女性人群中的頻率分別為37.35%和10.44%，差異有統計學意義，結合本次研究結果可推測北方女性對于URSA的易感性更強。本次研究所包含的9篇中文文獻中除2篇來自南方城市外，其他7篇均來自北方，可見URSA發病頻率在北方明顯高于南方，故應加強對北方女性人群實施增補葉酸等相關的預防策略。

盡管在本次研究中我們嚴格規定了所有檢索出的相關文獻的入選標準，Begg秩相關檢驗及Egger線性回歸法的檢驗結果均顯示無發表偏倚存在(除對中國以外的13篇文獻進行統計合并外)，但與其他所有系統分析一樣，本次分析在納入文獻方面實際上仍然存在一定的局限性。在檢索相關文獻的過程中我們僅通過Pubmed、萬方以及CNKI數據庫進行搜索，這就不免會遺漏某些未發表文獻。此外，入選的文獻數量有限，對于RSA的次數和時間的定義不盡相同，而且所使用的實驗室設備器材的規格和精確度參差不齊，對研究對象制定的入選標準之間也存在較大差異。有此類混雜因素存在，勢必會對最后合并的統計結果造成影響。但盡管如此，本次綜合分析所得出的結果具有重要參考價值，尤其對中國資料分析顯示的MTHFR C677T基因突變與URSA之間的高度關聯應引起關注。

綜上所述，本研究得出結論，在中國女性人群中，MTHFR C677T基因多態性與URSA的發生之間存在關聯，而在其他國家地區的人群中并未發現該危險因素與URSA之間的關聯。但由于所入選文獻之間異質性無法完全消除，諸多混雜因素均可對本次研究結果產生影響，其中針對中國人群的相關研究所得出的陰性結果極少被報道最有可能導致本次研究的結果為假陽性。因此，今后在本次研究的基礎上應繼續進行相關研究，以便進一步探究MTHFR C677T基因突變與URSA之間的關聯，進而在該病病因學上有所突破。

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