HPLC—DAD同時測定柘樹和構棘根與莖中4種黃酮類成分的含量

李波,王美,譚亞南,佟苗苗,翟延君

[摘要] 目的：分析比較柘樹與構棘根及莖中花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚的含量，為品種鑒定與質量評價提供科學參考。方法：采用高效液相二極管陣列檢測法（HPLCDAD），色譜柱為Agilent C₁₈（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）0.1%磷酸溶液梯度洗脫（0～15 min，35%～50% A；15 ～30 min，50%～65% A），檢測波長290 nm（花旗松素、柑桔素）和365 nm（槲皮素、山柰酚），柱溫30 ℃。結果：花旗松素、槲皮素的含量柘樹根明顯高于構棘根，柘樹莖明顯高于構棘莖，種間含量差異大；柑桔素、山柰酚的含量構棘根高于柘樹根，柘樹莖與構棘莖含量相當，種間含量差異小，同種藥用部位間含量差異大。結論：4種成分的含量在柘樹和構棘及其藥用部位根和莖都存在一定的差異，在臨床上不可混淆使用。

[關鍵詞] 柘樹； 構棘； HPLCDAD

與構棘Cudrania cochinchinensis（Lour.）kudo et Masam.的根收載于1977年版《中國藥典》 “穿破石”項下，具有止咳，退黃，活血，通絡的功效，主要用于肺結核，濕熱黃疸，脅肋疼痛，跌撲瘀痛，風濕痹痛等[1]。現代藥理研究證明，柘樹根及莖均具有較好的抗腫瘤作用，其主要成分為黃酮類化合物[2]，市售柘木糖漿用于晚期消化道腫瘤的治療早有應用[3]。對于柘樹的藥用部位，藥典收載為根，文獻報道根及莖均可藥用，而商品藥材比較混亂，或單獨為根、或根及莖混淆使用。而關于構棘的相關文獻資料較少。據報道，花旗松素、柑桔素、槲皮素和山柰酚均具有一定的抗腫瘤作用[45]，本文對這4種成分進行了含量測定，通過比較分析，旨在為柘樹、構棘的品種鑒定和質量評價提供科學參考，為臨床正確用藥提供科學依據。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器；國產AR 級 2140型電子天平，METTLER AB135S 1/10萬電子天平（瑞士）。

花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚對照品自制，經HPLC峰面積歸一化法計算，純度均大于98%。供含量測定用甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

柘樹C. tricuspidata的根及莖、構棘C. cochinchinensis的根及莖均由廣西中醫學院藥學院中藥鑒定教研室何報作教授采自南寧并鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent C₁₈（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱；流動相甲醇（A）0.1%磷酸水（B），梯度洗脫，0～15 min，35%～50% A；15～30 min，50%～65% A；柱溫30 ℃；流速1 mL·min^-1；花旗松素、柑桔素檢測波長為290 nm，槲皮素、山柰酚檢測波長為365 nm；進樣量10 μL。在上述色譜條件下，峰呈較好分離，色譜圖見圖1。

2.2 對照品的制備 取對照品花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚適量，精密稱定，各加甲醇制成每1 mL含花旗松素0.958 mg、柑桔素1.320 mg、槲皮素0.632 mg、山柰酚0.450 mg的對照品儲備液，搖勻，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取柘樹根、柘樹莖、構棘根、構棘莖藥材粉末（60目）約4 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇34 mL，25%鹽酸17 mL，稱重，回流提取2 h，冷卻，補足失重，過濾，定容于100 mL量瓶，0.45 μm微孔濾膜濾過濾，即得。

1. 花旗松素；2. 柑桔素；3. 槲皮素；4. 山柰酚；a.290 nm；b.365 nm。

圖1 對照品（A）及柘樹根（B）的HPLC圖

Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substance （A） and the root of Cudrania tricuspidata （B）

2.4 線性關系考察 分別精密吸取花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚對照品儲備液0.8，1.2，0.16，0.34 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得混合對照品溶液。分別精密吸取混合對照品溶液5，8，10，15，20，25 μL注入高效液相色譜儀測定。以對照品進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程，結果見表1。

2.5 精密度試驗 精密吸取同一濃度混合對照品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積。花旗松素，柑桔素，槲皮素，山柰酚峰面積的RSD分別為1.1%，0.94%，1.4%，1.2%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 精密吸取柘樹根樣品10 μL，分別于0，2，4，6，8，10 h分別進樣分析，記錄峰面積。花旗松素，柑桔素，槲皮素，山柰酚峰面積的RSD分別為1.1%，1.2%，0.70%，0.60%。表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 精密稱取柘樹根樣品6份，每份約2 g，按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，記錄各色譜峰峰面積。花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚峰面積的RSD分別為0.80%，1.1%，1.0%，0.90%，表明樣品重復性較好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的柘樹根樣品6份（花旗松素0.629 4 mg·g^-1、柑桔素1.963 3 mg·g^-1、槲皮素0.089 5 mg·g^-1、山柰酚0.299 6 mg·g^-1），每份約2 g，精密稱定，分別置圓底燒瓶中，精密加入對照品儲備液花旗松素1.3 mL、柑桔素3.0 mL、槲皮素0.3 mL、山柰酚1.3 mL，按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，記錄各色譜峰峰面積，計算平均回收率，結果見表2。

2.9 樣品的含量測定 按2.3項下方法制備供試品溶液，并按2.1項下色譜條件進行測定。柘樹根、柘樹莖、構棘根、構棘莖中花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚的平均含量見表3。

3 討論

花旗松素的含量柘樹根明顯高于構棘根，柘樹莖明顯高于構棘莖，種間含量差異大，同種藥用部位間含量差異小；柑桔素的含量構棘根高于柘樹根，柘樹莖略高于構棘莖，種間含量差異小，同種藥用部位間含量差異大；槲皮素的含量柘樹根明顯高于構棘根，柘樹莖明顯高于構棘莖，種間含量差異大，同種藥用部位間含量差異亦大；山柰酚的含量柘樹根略低于構棘根，柘樹莖與構棘莖含量相當，種間含量差異小，同種藥用部位間含量差異大。上述結果可以歸納為：柘樹和構棘的根中4種成分的含量均高于柘樹和構棘的莖，其中花旗松素的含量差異不大，其余三者差異較大；柘樹和構棘的種間差異體現在花旗松素、槲皮素的含量，兩者的含量均是柘樹（根、莖）明顯高于構棘（根、莖），而柑桔素和山柰酚的含量在柘樹（根、莖）和構棘（根、莖）之間的差異不大。4種成分的含量在柘樹和構棘的不同藥用部位、柘樹和構棘之間存在一定的差異，在臨床上不可混淆使用。

3.1 檢測波長的選擇 花旗松素和柑桔素的最大吸收波長為290 nm，槲皮素和山柰酚最大吸收波長為365 nm。如圖1所示，各成分在2個波長下的響應值相差較大，故選擇290，365 nm同時測定，方法更簡單，結果更準確。

3.2 提取方法的選擇 柘樹與構棘的根及莖中槲皮素與山柰酚大多以糖苷的形式存在[6]。實驗中發現，未經水解的樣品兩者的含量較低，水解后含量顯著升高，同時花旗松素和柑桔素的含量不受水解的影響，故本文對樣品進行了酸水解處理。采用以下2種方法進行提取方法研究，方法1：稱柘樹根樣品2.5 g，置于圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，稱重，回流提取1 h，冷卻，補足失重，過濾，精密移取續濾液10 mL，加入25%鹽酸2.5 mL，水浴回流水解30 min，快速冷卻，定容于25 mL量瓶，取樣，過濾，作為供試品溶液。方法2：稱柘樹根樣品4 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入甲醇40 mL，25%鹽酸10 mL，稱重，回流提取1 h，冷卻，補足失重，過濾，定容于100 mL量瓶，取樣，過濾，作為供試品溶液。結果方法1測得槲皮素、山柰酚質量分數為0.042 6，0.171 8 mg·g^-1，方法2測得槲皮素、山柰酚質量分數為0.082 2，0.250 1 mg·g^-1，表明方法2測得兩者的含量更高，且操作簡單可行，故選取方法2作為制備供試品的方法。

3.3 提取條件的研究 考察了甲醇25%鹽酸溶液的比例（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1）、不同提取水解時間（1，1.5，2，2.5 h）對提取效率的影響，結果表明：用甲醇25%鹽酸（2∶1），水解提取時間2 h，即能水解完全，且能保證pH不會太低。

本實驗通過測定柘樹與構棘根及莖中花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚的含量，分析比較了2個藥材品種及其2個藥用部位間4種黃酮類成分的含量差異，為指導臨床準確用藥，為藥材品種的鑒定與質量分析提供了科學依據。

[參考文獻]

[1] 中國藥典.一部[S].1977：443.

[2] 張志，吳海健，皮恩浩，等.柘樹黃酮體內外抗腫瘤作用研究[J].世界臨床藥物，2009，30（10）：601.

[3] 杜衛東，沈達明，宋曉華，等.柘木糖漿對胃腸道腫瘤手術后化療病人腫瘤標記物和細胞免疫的影響[J].臨床醫藥雜志，2004，17（3）：11.

[4] Ju Hyung Lee，Chi Hoon Park，Kyung Chae Jung，et al. Negative regulation of βcatenin/Tcf signaling by naringenin in AGS gastric cancer cell [J]. Biochem Biophys Res Commun，2005，335（3）：771.

[5] 廖崢嶸，沈永清，趙娟，等.山柰酚對人小細胞肺癌H446細胞凋亡的影響[J].河北師范大學學報：自然科學版，2011，35（5）：510.

[6] 李正言，翟延君，騰宇，等.不同商品柘木中槲皮素和山柰酚的含量測定[J].時珍國醫國藥，2009，20（9）：2186.

Simultaneous determination of four flavones in root and

stem of Cudrania tricuspidata and C. cochinchinensis by HPLCDAD

LI Bo， WANG Mei， TAN Yanan， TONG Miaomiao， ZHAI Yanjun*

（College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China）

[Abstart] Objective： To establish a HPLCDAD method for the determination of axifolin， naringenin， quercetin and kaempferol in Cudrania tricuspidata and C. cochinchinensis in order to provide a scientific reference for species identification and quality evaluation， by establishing. Method： The determination was performed by HPLCDAD on an Agilent C₁₈ column （4.6 mm×150 mm，5 μm） by gradient elution （015 min，35%50% A；1530 min，50%65% A） using methanol （A） and 0.1% phosphoric acid （B） as the mobile phase. The flow rate was 1 mL·min^-1. The detection wavelength was 290 nm for taxifolin and naringenin，365 nm for quercetin and kaempferol with column temperature at 30 ℃. Result： The content of axifolin and quercetin in the root of C. tricuspidata were remarkably higher than that in the root of C. cochinchinensis，and the content in stem of C. tricuspidata was also higher than that in the stem of C. cochinchinensis，the content of axifolin and quercetin was variable in different species. The content of naringenin and kaempferol in the root of C. cochinchinensis was visibly higher than that in the root of C. tricuspidata， and the content in the stems of the two herbs was similar， the content of naringenin and kaempferol was visibly variable in different medicinal parts of the herb， but similar between the two herbs. Conclusion： There′s some difference of the content of the four ingredients in different medicinal parts and different herbs， so clinical use should not be confused.

[Key words] Cudrania tricuspidata； Cudrania cochinchinensis； HPLCDAD

doi：10.4268/cjcmm20130205

[責任編輯 呂冬梅]