原兒茶酸衍生物的合成及活性研究

李取勝，王偉，韓秋俊，王鵬龍，李強，雷海民

[摘要] 目的：探討原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）及其衍生物體外清除DPPH自由基活性及對雞胚絨毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane， CAM）血管新生的影響。方法：利用芐基保護及芐酯水解等相關反應，得到PCA系列衍生物PCA-1，PCA-2，PCA-3，結構經1H，¹³C-NMR及MS驗證，并采用DPPH自由基體外抗氧模型、CAM對PCA及其衍生物的活性進行篩選。 結果：PCA及含有鄰二酚羥基的PCA-1的體外清除DPPH自由基活性較強；PCA，PCA-3對新生血管有一定的抑制作用，而PCA-2則能促進血管的新生（P<0.001）。結論：PCA分子結構中的鄰二酚羥基為體外清除DPPH自由基的活性部位；不含鄰二酚羥基，同時有羧基時能增強其促血管新生活性，但需要進一步的實驗驗證。

[關鍵詞] 原兒茶酸；衍生物；DPPH自由基；雞胚絨毛尿囊膜；生物活性

水溶性酚酸類成分原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）廣泛存在于老鸛草、丹參等常見中藥[1-2]以及復方丹參注射液、冠心寧注射液[3-4]等經典復方制劑。不僅具有顯著降低心肌耗氧量，提高心肌耐氧能力，減慢心率[5]等藥理作用，而且大量文獻報道其具有確切的體外抗氧化活性[6-8]，但并沒有通過實驗的方法尋找其抗氧化活性的位點的報道。本實驗采用芐基保護與芐酯水解的方法對PCA進行結構修飾，并選取體外清除DPPH自由基模型及雞胚絨毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane， CAM）模型來研究PCA及其衍生物的體外抗氧化活性及對血管新生作用的影響，并探索PCA相關活性的活性位點。

1 材料

雙線恒溫加熱磁力攪拌器SH-3A（北京金紫光科技發展有限公司），RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），分析天平（德國賽多利斯公司），LC-MS 2020（Shimadzu公司），Avance 500型核磁共振儀（F llanden， Switzerland），X-5顯微熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司），酶標儀specta Max190（美國Molecular Devices），PH計（梅特勒-托利多儀器有限公司），96孔板（美國Costar公司），雞胚孵化箱（北京方通孵化器廠），顯微鏡（日本Olympus公司320040型），CJT型超凈工作臺（北京長城空氣凈化工程公司）。

原兒茶酸（南京澤郎醫藥科技）；氯化芐、Vit C（北京化工廠）；DPPH、叔丁基對苯二酚（TBHQ， 阿拉丁試劑）；二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司）；雞胚（北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司）；吸附性明膠海綿（南京金陵制藥）。

2 方法與結果

2.1 PCA衍生物的合成設計

PCA結構中含有鄰二酚羥基、羧基，要確定體外抗氧化活性位點，必須對其官能團進行選擇性保護。芐基保護常被用于有機合成反應中，易與羧基、羥基選擇性結合，尤其在鄰二酚羥基保護中應用較多[9-11]，且芐基本身沒有其他官能團，故從實驗操作簡單角度選擇將PCA與溴化芐反應，分別得其衍生物PCA-1， PCA-2和PCA-3，主要設計路線及方法見圖1。

2.2 PCA衍生物的合成

2.2.1 化合物PCA-1的合成 取2.46 g PCA，溶解在20 mL干燥的二甲基甲酰胺（DMF）中，0.64 g氫氧化鈉溶于4 mL水并逐滴加入到DMF，混合液在冰浴下逐滴加入氯化芐1.85 mL，繼續攪拌20 min。室溫下攪拌20 h，升溫到50 ℃攪拌2 h。乙酸乙酯萃取3次，有機層依次水洗、飽和碳酸氫鈉洗、飽和氯化鈉洗，無水硫酸鎂干燥，過濾，回收乙酸乙酯得棕色固體，甲苯反復洗滌并干燥得到白色固體1.26 g，收率43%。mp 147～148 ℃。LC-MS m/z

a. 氯化芐/氫氧化鈉/二甲基甲酰胺/水， 室溫20 h，50 ℃ 2 h； b. 氯化芐/碳酸鉀/二甲基甲酰胺， 85 ℃，過夜； c. 氫氧化鉀， 水-乙醇 1∶2 ，70 ℃，2 h。

圖1 PCA衍生物的合成路線

Fig.1 Synthesis of PCA derivants

245.1 [M+H]⁺；¹H-NMR（DMSO-d₆，500 Hz）δ： 5.28（2H，s，1′-CH₂-），6.83（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），7.34～7.45（7H，m，Ar-H），9.40（1H，s，4-OH），9.81（1H，s，3-OH）；¹³C-NMR（DMSO-d₆，125 Hz）δ： 165.9（C-7），151.1（C-4），145.6（C-3），137.0（C-2′），129.0（C-4′，6′），128.5（C-5′），128.4（C-3′，7′），122.4（C-1），120.9（C-6），116.8（C-5），115.9（C-2），66.1（C-1′），與文獻[12]相當。

2.2.2 化合物PCA-3的合成 取1 g PCA溶于20 mL干燥DMF中，攪拌下加入2.96 g干燥的碳酸鉀，室溫下逐滴加入2.98 mL氯化芐并持續攪拌10 min，之后在氮氣保護下85 ℃攪拌過夜。反應結束冷卻至室溫，加100 mL水，用氯仿萃取3次（3×100 mL）。合并有機層，依次水洗、飽和氯化鈉洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，回收氯仿得到油狀物。將油狀物通過硅膠柱，石油醚-丙酮（10∶1）為洗脫液，得到2.3 g白色固體，收率83.6%。mp 66～68 ℃；LC-MS m/z 425.2 [M+H]⁺；¹H-NMR（CDCl3，500 Hz）δ： 5.23（2H，s，1″-CH₂-），5.26（2H，s，1-CH₂-），5.35（2H，s，1′-CH₂-），6.95（1H，d，J=9.0 Hz，H-5），7.35～7.51（15H，m，Ar-H），7.70～7.71（2H，m，H-2，6）；¹³C-NMR（CDCl3，125 Hz）δ： 166.1（C-7），153.0（C-4），148.3（C-3），136.8（C-2），136.5（C-2″），136.3（C-2′），128.7（C-4，6），128.6（C-4″，6″），128.5（C-4′，6′），128.2（C-5），128.1（C-5″），128.0（C-5′），127.9（C-3，7），127.4（C-3″，7″），127.2（C-3′，7′），124.1（C-1），123.0（C-6），115.5（C-2），113.2（C-5），71.2（C-1），70.8（C-1″），66.6（C-1′）。與文獻[13]一致。

2.2.3 化合物PCA-2的合成 取1.5 g（3.53 mmol）化合物PCA-3于50 mL圓底燒瓶中，加入20 mL乙醇，取1 g（17.85 mmol）氫氧化鉀溶于10 mL水中，慢慢加入燒瓶，反應液在70 ℃攪拌至反應液呈均一狀態。蒸去反應液中過量乙醇，加100 mL水，冷卻至室溫。逐滴加入4 mol·L^-1鹽酸酸化至不再產生白色沉淀為止（pH 3～4），過濾，水洗，抽濾至干燥，得1.0 g白色固體，收率84.8%。mp 187～188 ℃；LC-MS m/z 335.2 [M+H]⁺；¹H-NMR（DMSO-d₆，500 Hz）δ： 5.18（2H，s，1″-CH₂-），5.23（2H，s，1′-CH₂-），7.16（1H，d，J=9.0Hz，H-5），7.31～7.47（10H，m，Ar-H），7.56～7.53（2H，m，H-2，6），12.3（1H，br s，-COOH）；¹³C-NMR（DMSO-d₆，125 Hz）δ： 167.5（C-7），152.5（C-4），148.0（C-3），137.5（C-2″），137.2（C-2′），129.0（C-4″，6″），128.9（C-4′，6′），128.4（C-5″），128.3（C-5′），128.0（C-3″，7″），127.9（C-3′，7′），124.0（C-6），123.7（C-1），115.0（C-2），113.5（C-5），70.4（C-1″），70.3（C-1′）。與文獻[13-14]相當。

2.3 活性篩選

2.3.1 體外清除DPPH自由基活性篩選[15-18] 于DMSO中將Vit C，TBHQ，PCA及其衍生物PCA-1，PCA-2和PCA-3配制成質量濃度為10.0 g·L^-1的溶液，其中Vit C，TBHQ為陽性對照藥物；通過DPPH自由基清除實驗對上述化合物進行篩選，以確定PCA體外抗氧化活性的作用位點。

在96孔板中，每個樣品重復3次，待樣品和95%乙醇全部加完后，再加入0.1 mmol·L^-1 DPPH的95%乙醇溶液，室溫下避光反應20 min，在517 nm處測定吸光度A；DPPH自由基清除率=[1-（As-A0）/Ac] ×100%。其中，樣品組（As）：20 μL樣品+180 μL DPPH自由基溶液；對照組（Ac）：20 μL DMSO +180 μL DPPH自由基溶液；空白組（A0）：20 μL樣品+180 μL 95%乙醇。

2.3.2 對CAM模型的作用 參照文獻[19-20]，在無菌環境下給藥組加入PCA，PCA-1，PCA-2和PCA-3，給藥劑量為30 μg/雞胚；空白組加生理鹽水。采用Image-Pro Plus5.0軟件計數由載體輻射新生血管（直徑<100 μm）數目。

2.4 結果

2.4.1 清除DPPH自由基活性結果 當樣品在反應體系中質量濃度為1 g·L^-1時，以Vit C，TBHQ為陽性對照，PCA及其衍生物對DPPH自由基清除率見表1。

2.4.2 CAM模型篩選結果 加藥72 h后在解剖顯微鏡下觀察給藥組與空白組的CAM新生血管生長情況，發現給藥組PCA-2中新生毛細血管從載體邊緣輻射狀發出，其數目與空白組相比有所增多，其他幾組則不顯著。說明衍生物PCA-2對CAM新生血管有顯著性促進作用，見表2。

3 討論及結論

在PCA衍生物的合成過程中，均是參照文獻的操作來進行，但是PCA-1的產率（43%）與文獻[12]較高的產率（>80%）有較大差距，分析原因是堿水加入的速度對反應的影響較大，速度越快，酚羥基也會被活化，副產物就會增多，所以加入堿水速度較慢時能提高反應產率。同時，可考慮采用較弱的堿，如碳酸氫鈉、碳酸鉀等。PCA-3的合成也可采用溴化芐，其反應速率在常溫時就比較快，但其相對氯化芐價格較貴。故采用氯化芐時，為提高反應速率可提高溫度或者在反應液中加入碘化鉀。PCA-2由PCA-3水解得到，屬常規反應。

抗氧化實驗結果得出在體系質量濃度為1 g·L^-1時，比較PCA，PCA-1，PCA-2，PCA-3對DPPH自由基清除作用， 初步驗證了PCA體外清除DPPH自由基的活性位點為分子中鄰二酚羥基。

對于血管新生實驗，在藥物濃度為30 μg/雞胚時，PCA與PCA-3對血管新生有一定的抑制作用，但相對于空白組P>0.05（PCA： P=0.373；PCA-1： P=0.593；PCA-3： P= 0.063），組間差別不大。而PCA-2的新生血管數目為10.75±3.19，相對空白組P<0.001，說明衍生物PCA-2能促進血管的新生。比較上述衍生物的結構，可推測在PCA結構中不含鄰二酚羥基，同時存在羧基時有促血管新生活性，但這需要進一步驗證。

本實驗采用芐基保護的方法，對PCA的不同位點進行修飾，得其衍生物，該合成方法成熟，易操作。并采用DPPH自由基體外抗氧模型、CAM模型對PCA及其衍生物的活性進行篩選，為酚酸類或具有類似結構的化合物的結構修飾與相關活性研究提供了一定的參考。

[參考文獻]

[1] 張善玉，姜艷玲，樸惠順，等. HPLC測定老鸛草中的原兒茶酸[J]. 華西藥學雜志， 2007， 22（4）： 453.

[2] 芮建中，鄒漢法，袁倚盛，等. 毛細管電泳法分離丹參水溶性有效成分——丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸[J].中草藥，2000， 31（5）： 337.