分離自煙臺白玉霓種植園的釀酒酵母發(fā)酵特性研究

程仕偉，李林林，繆 靜，姜文廣，沈志毅，李記明*

（1.魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 應(yīng)用微生物研究所，山東 煙臺 264001；2.煙臺張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司 技術(shù)中心，山東 煙臺 265709）

在影響葡萄酒質(zhì)量的諸多因素中，發(fā)酵微生物、工藝條件、釀酒設(shè)備和生態(tài)條件與葡萄品種4個(gè)方面起了決定性的作用，這些因素的相互影響最終決定了葡萄酒的品質(zhì)，而釀酒微生物是葡萄酒質(zhì)量和感官風(fēng)格的決定性因素[1-3]。在其他因素相對穩(wěn)定的情況下，葡萄酒酵母的釀酒適應(yīng)性和釀造學(xué)特性在生產(chǎn)中的重要作用就顯得十分突出[4]。釀酒酵母性能的優(yōu)劣直接影響著葡萄酒品質(zhì)，其將葡萄汁中的糖類轉(zhuǎn)化為乙醇和CO2并生成高級醇酯類醛類等重要風(fēng)味物質(zhì)[5-7]。優(yōu)良葡萄酒酵母具備啟動發(fā)酵速度快、發(fā)酵能力強(qiáng)、殘?zhí)巧佟]發(fā)酸少、耐高酒精度、高SO2和酒體協(xié)調(diào)等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。然而目前多數(shù)葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)大量使用進(jìn)口活性干酵母，雖保證了發(fā)酵速率和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，卻導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)出現(xiàn)同質(zhì)化嚴(yán)重的問題[10]。

優(yōu)質(zhì)葡萄酒的生產(chǎn)需要具有產(chǎn)區(qū)特征且能體現(xiàn)葡萄酒特色和風(fēng)格的優(yōu)良酵母菌種[11]。因此加快我國本土釀酒酵母資源的開發(fā)利用，是生產(chǎn)特種葡萄酒的重要保證[12]。山東煙臺是我國釀酒葡萄及葡萄酒的主產(chǎn)區(qū)，從當(dāng)?shù)氐钠咸褕@區(qū)及特定的環(huán)境條件中分離具有優(yōu)良特性的葡萄酒酵母，對釀造具有地域特色和獨(dú)特風(fēng)格的產(chǎn)地葡萄酒有著重要的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以分離自煙臺白玉霓葡萄種植區(qū)的釀酒酵母為研究對象，通過其與商品化進(jìn)口活性干酵母的發(fā)酵特性比較研究，為后續(xù)深入研究進(jìn)而選育具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的菌株提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

自煙臺白玉霓葡萄種植園的葡萄葉片、果實(shí)、土壤和葡萄須根部位取樣，經(jīng)孟加拉紅選擇性篩選獲得本土酵母41個(gè)，經(jīng)鑒定有3株菌為釀酒酵母，分別為ZYYT-1、ZYYT-2、ZYYT-3。商品化酵母Actiflore F33 購自Laffort 公司，EC1118購自法國Lallemand公司，均由煙臺張?jiān)＜瘓F(tuán)技術(shù)中心提供。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

采用YPD（yeast extract peptone dextrose medium）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L。所有試劑均為分析純或生物純。

1.3 發(fā)酵性能指標(biāo)測定

1.3.1 發(fā)酵力測定

CO2失重法：將2%接種量的種液轉(zhuǎn)接到300mL滅菌的YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)。以CO2產(chǎn)生量為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制CO2產(chǎn)生量曲線。

1.3.2 產(chǎn)酒精能力測定

重鉻酸鉀比色法：用重鉻酸鉀氧化乙醇為醋酸后，根據(jù)反應(yīng)中生成的Cr3+的顏色在波長610nm處進(jìn)行比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出所含的酒精含量[13-14]。

1.3.3 總酸含量測定

采用國標(biāo)GB/T 15038-2006中的指示劑法，利用酸堿滴定原理，以酚酞作指示劑，用堿標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)堿的用量計(jì)算總酸含量[15]。

1.3.4 殘?zhí)橇繙y定

采用DNS比色法測定還原糖的含量。發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心2min得發(fā)酵上清液，取稀釋后的上清液1mL于試管中，加入1mL蒸餾水和3mL DNS試劑，煮沸10min，待冷卻后定容至25mL，波長540nm處測其吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對應(yīng)的葡萄糖量。

1.3.5 釀酒酵母耐受性測定

采用不同乙醇濃度（12%vol、14%vol、16%vol、18%vol）、檸檬酸濃度（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、SO2濃度（60mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L）的6mL YPD培養(yǎng)基（內(nèi)裝有杜氏管），接種已活化的菌液一環(huán)，28℃恒溫培養(yǎng)48h，記錄起始發(fā)酵時(shí)間并觀察產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵力比較

圖1 釀酒酵母的發(fā)酵力Fig.1 The fermenting power ofSaccharomyces cerevisiae

釀酒酵母發(fā)酵力測定結(jié)果見圖1。在接種后的24h內(nèi)，所有菌株均能快速啟動發(fā)酵。3株本土酵母菌中，盡管YTZY-2菌株前期啟動發(fā)酵能力略低于YTZY-1，但是其總體發(fā)酵產(chǎn)氣量均高于YTZY-1和YTZY-3。從篩選的本土釀酒酵母與商品化酵母的發(fā)酵力比較看，3株本土酵母的發(fā)酵能力低于Actiflore F33，但是高于EC1118，其中YTZY-2的發(fā)酵產(chǎn)氣量與Actiflore F33非常接近，故YTZY-2是實(shí)際釀酒應(yīng)用的潛力菌株。

2.2 產(chǎn)酒精能力與殘?zhí)橇拷Y(jié)果分析

從圖2可以看出，產(chǎn)酒精能力依次為YTZY-2＞YTZY-1＞EC1118＞Actiflore F33＞YTZY-3，YTZY-2和YTZY-1具有高產(chǎn)酒精能力，甚至高于商品化酵母EC1118和Actiflore F33。發(fā)酵液中的殘?zhí)橇靠梢苑从辰湍笇μ堑霓D(zhuǎn)化利用能力，如果初始含糖量相同，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇康停f明酵母對糖的轉(zhuǎn)化利用率高，則說明發(fā)酵能力強(qiáng)[16]。由圖3可以看出，與產(chǎn)酒精能力對應(yīng)的，發(fā)酵結(jié)束后YTZY-2菌株的殘?zhí)呛孔畹停踔恋陀谏唐坊湍傅陌l(fā)酵殘?zhí)橇浚砻骶昀锰穷惖哪芰^強(qiáng)，發(fā)酵較為徹底。

圖2 釀酒酵母產(chǎn)酒精能力Fig.2 The producing ability of alcohol bySaccharomyces cerevisiae

圖3 釀酒酵母的發(fā)酵殘?zhí)橇縁ig.3 Residual sugar content after 48h fermentaion bySaccharomyces cerevisiae

2.3 發(fā)酵后總酸量

總酸含量用來判定酵母產(chǎn)酸能力，酸類物質(zhì)雖不是酒類的香氣成分，但其是主要的呈味物質(zhì)。從圖4可以看出，產(chǎn)酸能力依次為YTZY-3＞YTZY-1＞EC1118＞YTZY-2＞Actiflore F33，其中YTZY-2菌株產(chǎn)酸量與商品化酵母EC1118和Actiflore F33基本處于同一水平。酸類物質(zhì)雖然是主要的呈味物質(zhì)，但是過高或過低均影響口感，酸含量需適中，否則將影響酒類的色、香、味[3]。綜上分析，初步判定篩選的釀酒酵母YTZY-2具有生產(chǎn)特色葡萄酒的潛力。

圖4 釀酒酵母的發(fā)酵產(chǎn)酸量Fig.4 Produced acid content bySaccharomyces cerevisiae

2.4 耐受酒精能力

釀酒酵母耐受酒精能力的結(jié)果見表1。商品化酵母EC1118和F33以及本土酵母YTZY-2均具有較好的酒精耐受力，其中EC1118在酒精度為18%vol時(shí)仍能繼續(xù)發(fā)酵，而YTZY-1和YTZY-3的耐受酒精能力較差。工業(yè)化葡萄酒釀造過程中酒精度一般為12%vol，YTZY-2、EC1118和F33在酒精度為12%vol時(shí)仍能夠持續(xù)發(fā)酵，具有較好酒精耐受能力。YTZY-2可以耐受的酒精度為16%vol。

表1 釀酒酵母對酒精濃度的耐受力Table 1 Alcohol tolerance ofSaccharomyces cerevisiae

2.5 耐受SO2能力

由表2可以看出，供試酵母耐受SO2能力大小為Actiflore F33＞EC1118＞YTZY-2＞YTZY-3＞YTZY-1，Actiflore F33在SO2濃度為200mg/L時(shí)仍能持續(xù)發(fā)酵，而YTZY-1耐受SO2能力較差。一般SO2在葡萄汁中添加量為一般為60mg/L即可起到較好的抑制雜菌效果，YTZY-2在SO2濃度為60mg/L時(shí)可以較好的發(fā)酵，可以耐受的SO2濃度為150mg/L，可以用于葡萄酒實(shí)際生產(chǎn)中。

表2 釀酒酵母耐受SO2 的能力Table 2 SO2 tolerance ofSaccharomyces cerevisiae

2.6 耐酸能力

表3 釀酒酵母的耐酸能力Table 3 Acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae

由表3可以看出，供試酵母耐受酸能力大小為Actiflore F33＞EC1118＞YTZY-2＞YTZY-3＞YTZY-1，Actiflore F33在檸檬酸質(zhì)量濃度為3%時(shí)仍能持續(xù)發(fā)酵，而YTZY-1和YTZY-3耐酸能力較差。YTZY-2可以耐受檸檬酸質(zhì)量濃度為2.5%。

3 結(jié)論

通過煙臺白玉霓葡萄種植園篩選的本土釀酒酵母與商品化活性干酵母的發(fā)酵特性比較研究，確定菌株YTZY-2的發(fā)酵力和產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)，產(chǎn)酸量適中，具有較強(qiáng)的工業(yè)化應(yīng)用潛力，而YTZY-1和YTZY-3的發(fā)酵效果欠佳。菌株耐受性比較研究表明，本土葡萄酒酵母YTZY-2具有一定的耐受酒精度、SO2和酸度能力，能夠在工業(yè)發(fā)酵條件下正常發(fā)酵。有關(guān)YTZY-2菌株的葡萄汁實(shí)際發(fā)酵效果評價(jià)正在進(jìn)行中。

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