火棘果酒在釀制過程中化學成分及其抗氧化特性的變化

蔣春蘭，莊 洋，朱定國，程 超，李 偉*

（湖北民族學院 生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000）

火棘為薔薇科蘋果亞科火棘屬的常綠野生灌木，產區均有果實代糧的歷史，恩施州野生火棘產量不低于10萬t。作為天然的野生果樹資源，火棘果是加工果汁、果酒的上佳原料。丁筑紅等[1]嘗試利用活性干酵母釀制干型火棘果酒，取得了滿意的效果；李勝敖等[2]將火棘鮮果壓榨后，接種酵母發酵，制得酒精度為12%vol的火棘發酵酒。趙曉明等[3]將火棘果經全汁低溫發酵成火棘果酒，具有飲用滋補雙重作用。王憲偉等[4]利用大曲將火棘果汁和糯米一起發酵釀造制備火棘黃酒，酒體鮮甜醇厚。李新社等[5]將火棘果汁利用安琪活性干酵母經過酒精發酵和醋酸發酵生產醋飲料。周文斌等[6]以火棘果為主要原料，經過酒精發酵、醋酸發酵等工序得到火棘果醋。雖然已有一些科研工作者對火棘果酒等發酵工藝進行了優化，但是在這些研究中，均未涉及發酵過程中參數調節對生物活性成分含量及其活性的變化的影響。因此本文重點研究發酵條件（如發酵溫度、接種量、糖的添加量等）對生物活性成分及生物活性的影響，為進一步開發恩施豐富的火棘資源提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

火棘果：采自于湖北省恩施市龍洞河顆粒飽滿、顏色鮮紅的成熟火棘果實。

1.2 實驗試劑

蘆丁（≥95%）：西安艾沃生物科技有限公司；安琪活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、水溶性維生素E（6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid，Trolox）、三吡啶三吖嗪（ferric-tripyridyl-triazine，TPTZ）：日本TCI公司；OPA、碳酸鈉、氫氧化鈉（分析純）：國家集團化學試劑有限公司；硫酸氫鈉、苯酚、過硫酸鈉、四硼酸鈉（分析純）：天津常福晨試劑有限公司。

1.3 實驗儀器

UV765紫外分光光度計、FA1004B型電子天平、PHSJ-3F實驗室pH計：上海精密儀器有限公司；800型離心機：上海手術器械廠；GZC-9140MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司；DL-5低速大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；FSH-2多功能勻漿機：武漢輕工業公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 火棘果酒發酵工藝

將采集的新鮮火棘果實稱取適量，勻漿，加入20%白砂糖、1%安琪酵母和162.5mg/L亞硫酸氫鈉，混勻后分裝發酵。在測定各成分之前先取發酵液在4000r/min離心15min，然后再每隔24h進行與之重復的試驗。

1.4.2 指標測定

（1）pH值測定：酸度計測定。

（2）酒精體積分數的測定。

按照參考文獻[7]，酒精計法測定火棘果酒樣品的酒精體積分數。

（3）黃酮含量測定

采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH方法[8]，以蘆丁標準品為標樣，以其質量（mg）為橫坐標，吸光度值A510nm為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=0.3991x-0.0178，R2=0.9922。

發酵液中黃酮含量測定：移取0.5mL發酵上清液，按標準曲線方法測定A510吸光度值，黃酮含量計算公式：

式中：V 為發酵液的測定體積，mL。

（4）多酚含量測定

FC法[9]：以沒食子酸為對照品，以其質量（mg）為橫坐標，吸光度值A765nm為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：y=1.2676x+0.0149，相關系數R2=0.9998。

發酵液中多酚含量測定：移取0.25mL發酵上清液，按標準曲線測定A765nm，多酚含量計算公式：

式中：V 為發酵液的測定體積，mL。

（5）總糖含量測定

苯酚-硫酸法[10]測定發酵液中總糖含量，以葡萄糖為標樣，以其質量（mg）為橫坐標，吸光度值A485nm為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：y=0.0086x-0.0175，相關系數R2=0.9991。

發酵液中總糖含量測定：移取適宜濃度發酵上清液，加入1mL 9%苯酚，搖勻，加5mL濃硫酸，搖勻，靜置30min，測定A485nm。

式中：V 為發酵液的測定體積，mL；n 為稀釋倍數。

（6）蛋白質含量測定

G-250法測定發酵液中蛋白質含量[10]，以牛血清白蛋白標樣為對照品，以其質量（μg）為橫坐標，吸光度值A595nm為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：y=0.0060x-0.0092，R2=0.9927。

發酵液中蛋白質含量測定：移取0.5mL發酵上清液，按標準曲線測定A595nm。

式中：V 為發酵液的測定體積，mL。

（7）游離氨基酸含量測定

OPA法[11]：精確稱取標準品鄰苯二甲醛（Ortho-pathaladehyde，OPA）40mg溶于1mL 甲醇，加入2.5mL 20%的SDS溶液，再加入0.1mol/L四硼酸鈉25mL，β-巰基乙醇100μL，蒸餾水定容至50mL（現配現用）。分別取0mL、0.04mL、0.08mL、0.12mL、0.16mL、0.20mL標準氨基酸溶液，再加入0.20mL、0.16mL、0.12mL、0.08mL、0.04mL、0.00mL蒸餾水，再分別加入4mL OPA溶液，搖勻。靜置3min，在波長340nm處測定吸光度值，以氨基酸濃度為x軸，吸光度值為y軸繪制曲線，算得回歸方程：y=0.0122x-0.0146，相關系數R2=0.9978。

發酵液中游離氨基酸的測定：移取0.1mL發酵上清液，加入0.1mL蒸餾水，搖勻，加入4mLOPA試劑，搖勻。靜置3min，測定A340nm。

式中：V 為發酵液的測定體積，mL。

1.4.3 抗氧化指標測定

（1）發酵液對ABTS自由基的清除作用

用2.45mmol/L過硫酸鉀配制7mmol/L ABTS儲備液，將此用10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋至波長734nm處吸光度值為0.7+0.02，取4mL ATBS測試液，加60μL對應的樣品提取液，反應6min后測定A732nm，即為A對照，取4mL ATBS測試液，加60μL樣品溶液搖勻后，反應6min后，測定A732nm，即為A樣品[12]。

（2）發酵液在FRAP體系中的還原作用

蒸餾水1mL，1.8mL TPTZ溶液，60μL樣品溶液混勻，37℃反應10min，測定A593nm，結果以μmol/L Trolox等量抗氧化能力（TEAC）表示[12]。

2 結果與分析

2.1 火棘果酒釀制過程中化學成分的變化

2.1.1 pH值和酒精度的變化

在不同發酵階段分別取發酵液進行酸度和酒精度測定，pH值和酒精度隨發酵時間的變化見圖1。

由圖1可見，發酵初期，發酵液的pH值有輕微下降的趨勢，但發酵進行到第2d時發酵液pH值開始回升，最后基本穩定在pH3.8～4.0之間。此外隨發酵過程的進行，果酒酒精體積分數不斷增大，尤其是在發酵的第2d，火棘果酒的酒精體積分數增幅較大，之后酒精體積分數開始小幅上升。這主要是由于酵母利用糖類物質產生乙醇。

圖2顯示火棘果酒發酵液中總糖含量逐漸下降，尤其是發酵的第1d，總糖含量大幅下降，這與發酵液中的酒精度增加是相對應的。由圖3可以看出，隨發酵液中多糖含量降低，發酵液的酒精度逐漸增加，二者具有對數相關性。

2.1.2 黃酮和多酚含量變化

圖1 pH值和酒精體積分數隨發酵時間的變化Fig.1 Changes of pH value and alcohol content during the fermentation

圖2 多糖含量隨發酵時間的變化Fig.2 Changes of polysaccharides content during the fermentation

圖3 多糖含量與酒精度關系Fig.3 Relation between polysaccharides and alcohol content

黃酮和多酚的變化趨勢很相似，均在發酵的1d后達到最高值，之后有輕微下降，但是在發酵第4d和第7d黃酮含量均有所回升，主要原因可能是火棘果中黃酮和多酚大部分為醇溶性，隨發酵時間延長酒精體積分數增加，黃酮和多酚浸出量逐漸增加，同時火棘果發酵過程中采用通風搖瓶發酵，這有可能導致發酵液中已經浸提出的黃酮、多酚的氧化，因此在后期導致二者含量略有下降。這與許亮等[13]的研究結果不同，主要原因可能是不同原料中黃酮種類不同。

圖4 黃酮和多酚含量隨發酵時間的變化Fig.4 Changes of flavonoides and polyphenoles content

2.1.3 蛋白質和游離氨基酸的含量變化

圖5 蛋白質和游離氨基酸含量隨發酵時間的變化Fig.5 Changes of protein and free amino acid content during the fermentation

由圖5可見，發酵液中游離氨基酸含量逐漸上升，可能有以下兩方面原因引起，一是火棘果原料本身的游離氨基酸在發酵過程中由于浸泡作用逐漸游離出來；二是蛋白質降解產生新的游離氨基酸。

蛋白質含量在發酵的2d中達到最高值，主要是火棘果發酵過程中蛋白質溶出量的增加導致；在發酵第3d～4d，其含量快速下降，此時發酵液的pH值維持在3.7，這有可能是此pH值達到了火棘果中部分蛋白質的等電點而導致蛋白質沉淀，致使蛋白質含量快速下降；5d以后呈現下降趨勢，這可能是由于蛋白質分解釋放出游離氨基酸而導致的。

2.2 發酵液抗氧化特性的變化

圖6 火棘果酒發酵過程中抗氧化作用的變化Fig.6 Changes of antioxidation activities during the fermentation

ABTS和FRAP法操作簡單，適合于常規實驗室大規模采用[14-15]，因此本文主要采用了這2種抗氧化指標。由圖6可以看出，發酵液對ABTS自由基的抑制率隨發酵時間的延長逐漸增加，但是發酵液在FRAP體系的還原作用卻在1d后達到最高值，之后呈現緩慢下降的趨勢。由于火棘果酒發酵液中成分復雜，因此在不同抗氧化體系中具體發揮作用的成分不同，導致不同抗氧化體系中發酵液的抗氧化功能的變化不同。同時由表1可看出，在FRAP體系中與發酵液的TEAC值最相關的化學成分是多酚和黃酮，達到了極顯著水平（二者prob＞F分別是0.000，0.004），發酵液的TEAC值與多糖含量呈顯著負相關，這主要是由于多糖降解產生乙醇類物質，而乙醇類物質提高了黃酮和多酚的含量。發酵液對ABTS自由基的清除能力最相關的化學成分是多肽，達到了極顯著水平（prob＞F=0.000），其次是與黃酮和多酚相關性，其相關性的顯著性僅有0.104和0.111，未達到顯著水平，這說明火棘果酒發酵液中有可能產生了一些功能性的多肽類物質，因此有待于進一步進行研究。

表1 發酵液的抗氧化能力與其化學成分的偏相關Table 1 Pearson correlation between antioxidant activities and chemical contents of ferment solution

3 小結

綜上所述，火棘果在發酵過程中，經酵母發酵作用，將大部分糖轉化為酒精；其中黃酮、多酚雖為醇溶，但因為火棘果酒發酵液酒精度并不是很高，并且因其易氧化，在發酵過程中其含量在發酵一天后緩慢下降，直至保持不變；通過蛋白質和游離氨基酸的實驗結果，可知部分蛋白質分解為游離氨基酸。另外，對其抗氧化性的研究，表明火棘果的發酵液具有很強的抗氧化作用，在整個發酵過程中對ABTS自由基的清除作用和TEAC值保持持續上升的趨勢。

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