動物組織中苯并咪唑類藥物多殘留ELISA方法的建立

陳 飛，萬宇平 *，馮 靜，劉春雪

（1.山東春雪食品有限公司，山東 萊陽 265200；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206）

苯并咪唑類藥物（Benzimidazoles）具有廣泛的生物活性，對于動物體內(nèi)各種寄生線蟲、絳蟲具有很強(qiáng)的驅(qū)殺作用，目前在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛。常用的苯并咪唑類藥物包括阿苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、噻苯咪唑和丙氧苯咪唑[1-2]。但由于苯并咪唑類藥物在實驗動物顯示致畸和致突變作用，且在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物亦有毒理作用，是食品殘留中重要的監(jiān)控對象。中國、美國、歐盟、日本等國家或地區(qū)將苯并咪唑類藥物列入限制使用的藥物和動物源性食品殘留檢測的監(jiān)控對象，并制訂了各種苯并咪唑類藥物（包括其某些代謝物）在不同動物體內(nèi)（包括肌肉、組織等）的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL），在不同的動物和不同的組織中最大殘留限量從10μg/kg～5mg/kg不等[3-4]。

目前對于苯并咪唑類藥物的分析方法較多，主要有氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometr，HPLC-MS/MS）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）及高效毛細(xì)管電泳法（highperformance capillary electrophoresis，HPCE）等[4-12]。氣-質(zhì)聯(lián)用法需要衍生化后測定，液-質(zhì)聯(lián)用儀設(shè)備較昂貴，反相高效液相色譜法則作為主要的分析技術(shù)，然而理化方法存在復(fù)雜、繁瑣、需要專業(yè)技術(shù)人員和專業(yè)技能、檢測成本高等問題，不能實現(xiàn)大批量樣品的快速檢測分析；ELISA以其靈敏度高、特異性好、操作簡便、成本低等優(yōu)點適合于大量樣品的快速篩選。本研究基于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)建立一種靈敏、快速檢測動物組織中苯并咪唑類藥物的多殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟苯咪唑、丙氧咪唑、甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、丙硫咪唑亞砜、芬苯達(dá)唑、多菌靈藥物標(biāo)準(zhǔn)品：購自美國Sigma公司；乙酸乙酯、甲醇及其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純：購自北京化學(xué)試劑公司；包被原（苯并咪唑類藥物半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物）、單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株為北京勒邦生物技術(shù)有限公司制備保存。

1.2 儀器與設(shè)備

8010S勻漿機(jī)：上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司；2000SBL電子天平：美國Setra公司；QL-901漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Anke TDL-40B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；DSY-Ⅲ氮吹儀：北京金科精華苑科技有限公司；微量移液器（單道20μL～200μL、100μL～1000μL，多道250μL）：美國Thermo公司；DHP-600生化培養(yǎng)箱：天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；MK3酶標(biāo)儀：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 ELISA檢測條件的優(yōu)化

采用方陣滴定法，確定抗原、抗體最佳工作濃度，為保證達(dá)到最佳檢測條件，對包被時間、封閉時間、競爭反應(yīng)時間、顯色溫度時間等條件進(jìn)行篩選優(yōu)化[13]。

1.3.2 酶標(biāo)抗體的合成

采用過碘酸鈉氧化法[14]用辣根過氧化物酶標(biāo)記單克隆抗體，合成酶標(biāo)抗體。

1.3.3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過優(yōu)化以上ELISA檢測條件，對不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品曲線進(jìn)行回歸分析，建立競爭ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣本前處理方法

優(yōu)化不同的試劑及提取時間，建立回收率最好的動物組織樣本前處理方法。

1.3.5 ELISA檢測方法結(jié)果分析

采用競爭ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別選擇氟苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L，以質(zhì)量濃度為0μg/L時的OD值為B0值，其他質(zhì)量濃度的OD值為B值，以百分吸光率B/B0為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。用同樣的辦法計算樣本溶液的百分吸光率，將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的質(zhì)量濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中苯并咪唑類藥物的質(zhì)量濃度。

1.3.6 特異性試驗

將8種苯并咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品用0.02mol/L的PBS溶解，均配制出各系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行ELISA測定。按下列公式計算交叉反應(yīng)率：

式中：X為引起50%抑制的氟苯咪唑濃度，μg/L；Y為引起50%抑制的其他苯并咪唑類藥物濃度，μg/L。

1.3.7 靈敏度試驗

用IC50值和檢測限來評價方法的靈敏度。分別測定20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50，統(tǒng)計其平均值和浮動范圍；并測定20個空白樣本，求出其B/B0在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的濃度的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），方法檢測限（method detection limit，MDL）即為MDL=（）+3s。

1.3.8 添加回收試驗

分別取空白雞肉、豬肉、牛肉樣本，以8μg/kg、16μg/kg、32μg/kg 3個質(zhì)量濃度的氟苯咪唑藥物對其進(jìn)行添加回收試驗，將樣本前處理后進(jìn)行ELISA測定，每個樣品做5個平行，計算添加回收率和變異系數(shù)。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗

將足量的ELISA方法涉及到的各種試劑及酶標(biāo)板保存于37℃環(huán)境中，每隔1d取出適量，分別測定零標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、IC50，及按1.3.8所述方法進(jìn)行添加回收試驗所測得的回收率，直到試劑盒的靈敏度和回收率開始下降為止，根據(jù)實驗結(jié)果判斷試劑盒的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA檢測方法的建立

2.1.1 酶標(biāo)板的制備

通過實驗篩選，用包被緩沖液將包被原稀釋每孔加入100μL，37℃避光孵育2h，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌1次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150μL封閉液，37℃避光孵育2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

2.1.2 樣本前處理方法的建立

雞肉、豬肉樣本的前處理：稱取（1.0±0.05）g均質(zhì)物至50mL 聚苯乙烯離心管中，加入7.7mL 乙酸乙酯和0.3mL甲醇，用渦旋儀渦動至混勻；3000×g以上、室溫（20℃～25℃）離心5min；移取1mL 上層有機(jī)相至10mL干凈玻璃試管中，于50℃～60℃水浴氮氣/空氣流下吹干；加入2mL 復(fù)溶工作液渦動30s，取50μL用于分析。

牛肉樣本前處理方法：稱取（1.0±0.05）g用均質(zhì)器均質(zhì)的樣本至50mL聚苯乙烯離心管中；加入7.3mL乙酸乙酯和0.7mL甲醇，用渦旋儀渦動至均勻。3000×g以上、室溫（20℃～25℃）離心5min；移取1mL上層有機(jī)相至10mL 干凈玻璃試管中，于50℃～60℃水浴氮氣/空氣流下吹干；加入2mL復(fù)溶工作液，渦動30s；取50μL用于分析。

2.1.3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)方法的建立

通過實驗篩選，建立ELISA檢測步驟繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。向制備好的酶標(biāo)板中加入系列濃度的氟苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL/孔，再加入酶標(biāo)抗體50μL/孔，25℃避光反應(yīng)30min；洗滌4～5次后加入底物液A液（過氧化脲）50μL/孔，再加入底物液B液（四甲基聯(lián)苯胺）50μL/孔，25℃顯色15min加入2mol/L H2SO4終止液，50μL/孔，設(shè)定酶標(biāo)儀于波長450nm處測定每孔吸光度值（OD值）。

2.1.4 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)競爭ELISA方法，選擇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度0μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L，以百分吸光率（B/B0）為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。以lg（B/B0）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，將圖1轉(zhuǎn)換后可知，在0.5μg/L～8.0μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，lg（B/B0）與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2），得回歸方程y=-2.769x+0.539，R2=0.9980，IC50為1.5μg/L。

圖1 苯并咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of benzimidazoles

圖2 苯并咪唑類藥物競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Calibration curve for detection of by ELISA

2.2 ELISA檢測方法的評價

2.2.1 特異性

交叉反應(yīng)率測定結(jié)果見表1。從表1可知，選用的單克隆抗體對苯并咪唑類藥物中的氟苯咪唑、丙氧咪唑、甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑均有50%以上的交叉反應(yīng)率，采用此單克隆抗體建立的ELISA方法可以用于動物組織中的苯并咪唑類藥物的多殘留檢測。

表1 苯并咪唑類藥物的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross-reactivity of benzimidazoles

2.2.2 靈敏度試驗

統(tǒng)計20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50平均值為1.2μg/L，浮動范圍為0.9μg/L～1.5μg/L；20個空白樣本的B/B0在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的濃度的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）見表2。綜合考慮幾種樣本的檢測限數(shù)據(jù)，得本方法對動物組織中苯并咪唑類藥物的檢測限為8μg/kg。

表2 方法檢測限（n=20）Table 2 Detection limits of ELISA method（n=20）

2.2.3 添加回收試驗

ELISA 測定的準(zhǔn)確度用回收率表示，精密度用變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示。以空白雞肉、豬肉、牛肉樣本為試驗材料，向其中分別添加氟苯咪唑藥物標(biāo)準(zhǔn)品，添加質(zhì)量濃度為8μg/kg、16μg/kg、32μg/kg，檢測結(jié)果見表3。

表3 ELISA方法的精密度和準(zhǔn)確度Table 3 Precision and accuracy test of the ELISA

結(jié)果表明，動物組織中氟苯咪唑藥物回收率范圍為79.8%～100.5%，說明方法準(zhǔn)確性較高；變異系數(shù)范圍為7.2%～9.5%，均小于15%，說明方法精密度（重復(fù)性）較好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

將ELISA方法涉及到的各種試劑放置于37℃保存15d，每隔1d取出，測定靈敏度和回收率等參數(shù)。經(jīng)測定，涉及到的各種試劑能在37℃條件下穩(wěn)定保存測定值均在正常范圍之內(nèi)。一般來講，在37℃每穩(wěn)定1d，可相當(dāng)于4℃～10℃保存一個半月[15]，在實際應(yīng)用中，試劑盒一般存放在2℃～8℃冰箱，所以對于整體試劑盒的穩(wěn)定性評判，還需要進(jìn)行2℃～8℃放置保存試驗，從而進(jìn)一步驗證試劑盒的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

酶聯(lián)免疫法因靈敏度高、特異性好、操作簡便、檢測成本低、一次性檢測樣本量大等特點，能夠更好地滿足我國畜禽養(yǎng)殖戶、食品企業(yè)、政府監(jiān)管部門等開展檢測工作。本研究以實驗室自制的單克隆抗體為基礎(chǔ)，初步建立了動物組織中苯并咪唑類藥物多殘留檢測的酶聯(lián)免疫吸附法。該方法的IC50浮動范圍為0.9μg/L～1.5μg/L，動物組織樣本的檢測限為8μg/kg；樣本添加回收率為79.8%～100.5%，變異系數(shù)為7.2%～9.5%；可用于檢測多種苯并咪唑類藥物，并且樣本前處理簡單、儀器設(shè)備投資少、檢測成本低，適合于大批量樣本中苯并咪唑類藥物殘留檢測的快速篩選。

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