葡萄糖氧化酶活性變化的分析

周生民，趙 偉

（山東福洋生物科技有限公司，山東 德州 253100）

葡萄糖酸鈉是一種多羥基羧酸鈉，白色結晶顆粒或粉末，極易溶于水，微溶于酒精，不溶于乙醚，又被稱為五羥基已酸鈉，分子式為C6H11O7Na，分子質量為218.14，含量大都在98%以上。目前，葡萄糖酸鈉生產普遍采用黑曲霉發酵法生產。據統計黑曲霉發酵中產生的酶有過氧化氫酶、纖維素酶、半乳糖酶、葡萄糖氧化酶等20多種酶[1-2]。其中，葡萄糖氧化酶在葡萄糖氧化反應中起主導作用。因此，對葡萄糖氧化酶的研究直接影響葡萄糖酸鈉的生產。

葡萄糖氧化酶系統稱為β-D-葡萄糖氧化還原酶（glucose oxidase，GOD），是一種淡黃色透明液體酶制劑，能催化葡萄糖氧化成葡糖酸并產生過氧化氫的酶。該酶含有兩分子黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）的黃素蛋白，圖1為葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖為葡萄糖酸的反應機理[3-4]。

葡萄糖氧化酶的pH穩定范圍較寬，在pH4～8范圍內較穩定。酶蛋白在pH5.0～5.5范圍酶活基本不變，在pH6～8范圍內也較穩定，酶活力均保持在72%以上。葡萄糖氧化酶蛋白在20℃～50℃范圍內熱穩定性很好，30℃時酶活力比原酶活力可上升16%，60℃時酶活力下降至51%，70℃時下降更為顯著[5]。葡萄糖是該酶的穩定劑，一般來說，酶反應受底物濃度的影響不大，葡萄糖濃度為5%～20%，反應速度幾乎不變[6]。

葡萄糖酸鈉具有非常廣泛的用途，在建筑業中被廣泛用作水泥緩凝劑，可以防止混凝土在運輸的過程中凝固和結塊現象，另外還可被用作鋼鐵表面清洗劑、阻垢緩蝕劑。食品級和醫藥級產品，可以調節人體的酸堿平衡，有效防止低鈉綜合癥的發生，用作食品添加劑和醫藥中間體等。

圖1 葡萄糖氧化酶氧化機理Fig.1 Oxidation mechanism of glucose oxidase

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）：福洋生物科技有限公司保藏菌種。

1.2 儀器與設備

小型在線檢測發酵罐：國強生化有限公司；722紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；電爐：武漢嘉華爐業有限公司；MAX300LG質譜儀：杭州瑞析科技有限公司；XSPBM-2CBAC顯微鏡：西派克光學儀器有限公司；HA-HH-4恒溫水浴鍋：環宇科學儀器廠。

1.3 方法

葡萄糖氧化酶酶活定義：在pH5.6，溫度為30℃條件下，每分鐘催化1μmol葡萄糖轉化為葡萄糖酸和過氧化氫所需的葡萄糖氧化酶的量為一個酶活力單位（U）。

根據酶的pH穩定性和底物濃度穩定性，選擇發酵液pH5.2左右和糖濃度19%時取發酵液過濾處理，在酶活相對穩定的環境下測定此時酶活并記錄。取4支離心管分別標號Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，將過濾后的發酵液分別裝入4支離心管，將Ⅰ號離心管存放在4℃冰箱內，將Ⅱ號離心管常溫25℃保存，Ⅲ號離心管放入37℃恒溫箱保存，Ⅳ號離心管放入70℃恒溫箱保存，每1h檢測1次酶活并記錄。

酶活檢測：分別添加2.4mL用無水乙酸鈉稀釋的鄰聯茴香胺、0.5mL 10%葡萄糖溶液、0.1mL辣根過氧化氫酶溶液于35℃水浴鍋提前預熱5min。檢測時向混合溶液中添加0.1mL過濾后的發酵液，于波長500nm處每30s記錄吸光度值（A500nm），每30s記錄一次，以A500nm對時間作圖，找出最大斜率△A/min。酶活計算公式如下：

注：7.5為氧化型鄰聯茴香胺的消光系數。

測定過程中維持發酵液葡萄糖氧化酶活性測定結果在1000U/mL左右為宜，活性過高則應稀釋，不得超過5000U/mL。

2 結果與分析

根據葡萄糖氧化酶pH穩定性和底物濃度穩定性，對所取樣品進行檢測，測得的pH值為5.3，葡萄糖濃度為18%，都處于葡萄糖氧化酶活力穩定范圍[7]。每1h對所取的3個處于不同溫度的樣品進行酶活性檢測。

圖2 不同溫度下酶活隨時間的變化趨勢Fig.2 Change of enzyme activity at different temperatures

從圖2可以看出，保存于4℃的樣品不同時間所測得的酶活性基本接近于初始值，保存于25℃、37℃和70℃的樣品都偏離初始值，25℃時所測得的酶活性呈上升趨勢，比初始值有所上升，而37℃和70℃時所測得的酶活性有下降趨勢，并且溫度處在70℃時酶活性下降最明顯。

從圖2還可以看出，葡萄糖氧化酶活性范圍比較寬，從4℃～70℃葡萄糖氧化酶都存在活性，4℃和25℃葡萄糖氧化酶的穩定性都比較好，而25℃更接近于真實值，37℃和70℃葡萄糖氧化酶波動較大不能真實反映酶的活性，從酶的動力學方面看，可能是溫度對酶的活性基團有一定的影響，才改變了不同溫度下酶的活性[7-9]。

3 結論

在產葡萄糖酸鈉的黑曲霉發酵過程中，氧化葡萄糖形成葡萄糖酸鈉的酶是葡萄糖氧化酶，其活性決定了耗糖速率大小和產酸的快慢，所以研究酶活性的變化趨勢相當重要[10-11]。發酵液中酶活性在取樣之后立刻檢測才能較真實反映酶的活性，從圖2中可以看出，酶在4℃時酶活性基本保持與初始值相似基本反映發酵過程中酶活力的大小。而25℃、37℃和70℃時酶活性都偏離了初始值，也就都偏離了發酵罐中酶的真實活性[12-13]。

葡萄糖酸鈉發酵是一個復雜的生物發酵過程，其中存在各種酶參與的各種復雜的生物化學反應，只有了解了酶活的變化趨勢才能更好的控制生產工藝，才能使發酵過程中的酶達到最高效的催化氧化的效果，產品的質量和產量才能進一步得到提高[14-15]。

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