化學(xué)發(fā)光法檢測不同干燥方法對金銀花抗氧化活性和化學(xué)成分的影響

王梅，劉峰，林昌虎，張清海，張永清，劉建華，王曉*

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250014;2.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014;3.貴州省理化測試分析研究中心，貴州省科學(xué)院，貴州 貴陽 550002;4.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355)

金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或帶初開的花［1］，具有抗氧化、抗病毒、抗生育、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、涼散風(fēng)熱，清熱解毒等功效［2］，對結(jié)核桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌等也有很強的抑制作用［3－4］。金銀花中含有的豐富的黃酮類和多酚類物質(zhì)具有較強的抗氧化活性［5］，可以清除體內(nèi)的O－2、HO·和H2O2等，起到增強機體免疫力和延緩衰老的作用。

目前已有文獻研究不同干燥方法對金銀花中某種活性成分的影響［6］，但是對于不同干燥方法對金銀花提取物的抗氧活性和總酚、總黃酮質(zhì)量分數(shù)的影響研究很少。本實驗采用操作簡單、快捷靈敏的化學(xué)發(fā)光法［7］，利用魯米諾化學(xué)發(fā)光體系探討了不同干燥方法對金銀花的抗氧化活性以及其中的總酚和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)的影響，為金銀花資源的進一步開發(fā)研究提供了理論依據(jù)。

1 儀器與材料

儀器:MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測試系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司);722E型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);GZX-9140數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海宏博實業(yè)有限公司);YZWZ-3型微波干燥箱3kW(南京研正微波設(shè)備廠);SB-5200D型超聲波清洗機30 kHz(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

金銀花于2012年7月采于山東濟南平陰基地。

試劑:0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，使用前新鮮配制，調(diào)節(jié)至pH=10.2;魯米諾(Luminol)溶液，用pH=10.2，濃度為0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配置成0.2 mmol/L，避光保存;鄰苯三酚溶液，用1 mmol/L的HCl溶液配置成10mmol/L;FeSO4溶液，先用1mL的0.5 mol/L的H2SO4溶液將FeSO4晶體溶解，然后用水稀釋至0.5 mmol/L;H2O2溶液，用水將H2O2配置為體積分數(shù)為0.6%和0.06%的溶液;抗壞血酸溶液，精確取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品2.48mg，用二次蒸餾水溶解配制成0.248mg/mL，然后用二次蒸餾水依次稀釋為 0.0248、0.00496、0.00248、0.00124、0.000496、0.00031 mg/mL。本實驗所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

2 實驗方法

2.1 金銀花的干燥和提取

2.1.1 金銀花的干燥

金銀花采用3種不同的干燥方法做比較。(1)微波法:在微波干燥器中加入金銀花鮮樣100 g，設(shè)定微波功率3 kW，溫度70℃，干燥時間10min，得到干基重22 g。(2)鼓風(fēng)干燥法:在鼓風(fēng)烘箱中加入金銀花鮮樣100 g，設(shè)定溫度為40℃，干燥時間14 h，得到干基重22 g。(3)晾干法:將100 g金銀花鮮樣在自然條件下晾4 d，得到干基重22 g。

2.1.2 金銀花的提取

取不同方法干燥的金銀花樣品，粉碎，過40目篩，各樣品分別取1.0 g，以體積分數(shù)為50%的乙醇溶液按照料液比1:50(g/mL)超聲提取30min，提取液過濾、離心后，用50%乙醇定容至50mL，得到不同干燥方法的金銀花提取液。

2.2 金銀花提取液化學(xué)成分的測定

2.2.1 總黃酮的測定

參照文獻［8］，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系測定金銀花提取液中總黃酮的質(zhì)量分數(shù)。以試劑空白為參比，在510 nm處測定樣品的吸光度值，得到的黃酮質(zhì)量分數(shù)用相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)來表示，測3次取平均值。得到線性回歸方程:y=9.54278 ×10－4+0.01042x，R2=0.9996，蘆丁質(zhì)量分數(shù)在 0 ～10 μg/mL時與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 總酚的測定

參照文獻［9］，采用Folin酚法對金銀花提取物中總酚質(zhì)量分數(shù)進行測定。以試劑空白為參比，在765 nm處測定樣品的吸光度值，得到的總酚質(zhì)量分數(shù)以相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)來表示，測3次取平均值。得到回歸方程:y=0.01166+0.11869x，R2=0.9992，沒食子酸質(zhì)量分數(shù)在0 ～74 μg/mL 時與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.3 金銀花提取物抗氧化活性實驗

采用魯米諾－鄰苯三酚化學(xué)發(fā)光體系［10］，以體積分數(shù)7.5% 的乙醇溶液為空白。將3種不同干燥方法的金銀花提取液配制成不同的濃度梯度(1%、3%、5%、10%、15%，乙醇體積分數(shù)均為7.5%)，陽性對照組為抗壞血酸溶液配制成不同的濃度(0.0248、0.00496、0.00248、0.00124、0.000496、0.00031 mg/mL)，打開反應(yīng)池與光電倍增管的連接開關(guān)，將光電倍增管高壓設(shè)置在800 V，在樣品池中依次加入魯米諾溶液4 mL、樣品(或空白)溶液0.5 mL、鄰苯三酚溶液0.4 mL，立即啟動儀器，記錄其在400 s內(nèi)的發(fā)光積分強度。以空白的發(fā)光強度作為本底發(fā)光強度I0，以抗壞血酸溶液做陽性對照。以清除率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，計算清除率在50%時的濃度IC50，平行測定3次取平均值。

2.3.2 H2O2清除率的測定

采用魯米諾－H2O2化學(xué)發(fā)光體系［11］，以體積分數(shù)5%的乙醇溶液為空白。將3種不同干燥方法的金銀花提取液配制成不同的濃度梯度(0.02%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%、5%、10%，乙醇體積分數(shù)均為5%)，陽性對照為抗壞血酸溶液，濃度同2.3.1，打開反應(yīng)池與光電倍增管的連接開關(guān)，將光電倍增管高壓設(shè)置在600 V，在樣品池中依次加入魯米諾溶液4 mL、樣品(或空白)溶液0.5 mL、H2O2溶液0.2 mL，立即啟動儀器，記錄其在200 s內(nèi)的發(fā)光積分強度。以空白的發(fā)光強度作為本底發(fā)光強度I0，以抗壞血酸溶液做陽性對照，計算其IC50。平行測定3次取平均值。

2.3.3 HO·清除率的測定

采用魯米諾-FeSO4-H2O2化學(xué)發(fā)光體系［12］，以體積分數(shù)5%的乙醇溶液為空白。將3種不同干燥方法的金銀花提取液配制成不同的濃度梯度(0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%、5%、10%，乙醇體積分數(shù)均為5%)，陽性對照為抗壞血酸溶液，濃度同2.3.1，打開反應(yīng)池與光電倍增管的連接開關(guān)，將光電倍增管高壓設(shè)置在800 V，在樣品池中依次加入魯米諾溶液4 mL、樣品(或空白)溶液0.5 mL、FeSO4溶液0.2 mL、H2O2溶液0.2 mL，立即啟動儀器，記錄其在400 s內(nèi)的發(fā)光積分強度。以空白的發(fā)光強度作為本底發(fā)光強度I0，以抗壞血酸溶液做陽性對照，計算其IC50。平行測定3次取平均值。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗所得數(shù)據(jù)，用Origin 6.0軟件統(tǒng)計，計算所得曲線的積分面積為相對發(fā)光強度，計算清除率用如下公式:

其中I0表示不加樣品時的空白發(fā)光強度，I表示加入金銀花提取物樣品時的發(fā)光強度。

所得清除率曲線，采用Origin 6.0軟件進行Sigmoidal擬合，擬合公式為

其中y為清除率，x為提取物濃度，當(dāng)y=50%時對應(yīng)的x即為IC50。式中A1，A2，x0和p對應(yīng)的值如表1所示。

表1 公式(2)參數(shù)數(shù)值Table 1 Parameter values of formula(2)

3 結(jié)果與討論

3.1 不同干燥方法處理的金銀花提取液中的總酚、總黃酮

不同干燥方法處理的金銀花提取液中的總黃酮和總酚的質(zhì)量分數(shù)如表2所示。其中在70℃微波干燥10min條件時，金銀花提取液中的總酚和總黃酮質(zhì)量分數(shù)最高，分別為30.40±2.75 mg/g和61.24±7.62 mg/g，而在自然陰干4 d的條件下，金銀花提取液中的總酚和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)最低，分別為10.22±0.81 mg/g和17.50±2.28mg/g。由此可以得出，微波干燥的方法快捷且總酚、總黃酮質(zhì)量分數(shù)最高。

表2 不同干燥方法處理的金銀花提取物的IC50及其總酚總黃酮的質(zhì)量分數(shù)Table 2 IC50and the content of total phnolic and total flavonoid of honeysuckle extracts by different drying methods

3.2 金銀花提取物對O－2的清除作用

魯米諾－鄰苯三酚化學(xué)發(fā)光體系的原理［10］為:以魯米諾為發(fā)光劑，鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生的將魯米諾過氧化，使產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)中間產(chǎn)物返回到基態(tài)而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，并且其發(fā)光強度與在一定強度范圍內(nèi)成線性關(guān)系。加入金銀花提取物后，由于其含有豐富的黃酮類和多酚類化合物，其結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，可以提供活潑氫，從而阻斷了該體系中自由基的反應(yīng)，抑制了其化學(xué)發(fā)光。

3.3 金銀花提取物對H2O2的清除作用

H2O2將化學(xué)發(fā)光劑魯米諾過氧化，產(chǎn)生電子激發(fā)態(tài)中間產(chǎn)物，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，可集中釋放光子，發(fā)出化學(xué)冷光［13］，且其化學(xué)強度與H2O2的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。本實驗中，加入金銀花提取物后，由于其中含有豐富的黃酮類化合物和多酚類化合物，具有較強的還原性，阻斷了該體系的反應(yīng)，抑制了其化學(xué)發(fā)光。

圖2顯示，3種干燥方法處理的金銀花對H2O2的清除率的IC50分別為微波＜鼓風(fēng)干燥＜陰干，這與表2中的總酚和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)呈正相關(guān)。因此，可以得出微波干燥處理的金銀花提取液的總酚和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)最高，去除H2O2的能力最強，清除H2O2的IC50相當(dāng)于0.0019 mg/mL的抗壞血酸溶液。

3.4 金銀花提取物對HO·的清除作用

由Fenton試劑中的Fe2+和H2O2反應(yīng)生成羥基自由基，魯米諾作為發(fā)光增效劑與HO·發(fā)生反應(yīng)，發(fā)出化學(xué)冷光，并且其發(fā)光強度與HO·在一定強度范圍內(nèi)成線性關(guān)系。當(dāng)加入金銀花提取物之后，由于其中含有大量的黃酮和多酚，將Fe2+氧化為Fe3+，阻斷了該體系的反應(yīng)，抑制了其化學(xué)發(fā)光。

圖3顯示，3種干燥方法處理的金銀花對HO·的清除率的IC50分別為微波＜鼓風(fēng)干燥＜陰干，這與表2中的總酚和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)呈正相關(guān)。因此，微波干燥處理的金銀花提取液的總酚和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)最高，其去除HO·的能力最強，清除HO·的IC50相當(dāng)于0.0013 mg/mL的抗壞血酸溶液。

圖3 不同干燥方法處理的金銀花提取物的HO·的清除作用Fig.3 Scavenging activity of hydroxyl free radical of honeysuckle extracts by different drying methods

4 結(jié)論

金銀花含有大量的酚類和黃酮類化合物，并且具有較強的抗氧化活性，且抗氧化活性與提取液的濃度呈正相關(guān)。不同干燥方法對金銀花活性物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)和抗氧化活性有較大的影響，其中微波干燥的時間最短，總酚和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)最高，分別為30.40 ±2.75 mg/g、61.24 ±7.62 mg/g，并且抗氧化活性最強;鼓風(fēng)干燥次之;而自然陰干的時間最長，總酚和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)最低，分別為10.22±0.81 mg/g、17.50±2.28mg/g，且抗氧化活性最弱。這表明，過長的干燥時間會導(dǎo)致活性物質(zhì)的流失，不利于保持金銀花的活性成分。

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