化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)不同干燥方法對(duì)金銀花抗氧化活性和化學(xué)成分的影響

王梅，劉峰，林昌虎，張清海，張永清，劉建華，王曉*

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014;2.山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014;3.貴州省理化測(cè)試分析研究中心，貴州省科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002;4.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花［1］，具有抗氧化、抗病毒、抗生育、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、涼散風(fēng)熱，清熱解毒等功效［2］，對(duì)結(jié)核桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌等也有很強(qiáng)的抑制作用［3－4］。金銀花中含有的豐富的黃酮類和多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性［5］，可以清除體內(nèi)的O－2、HO·和H2O2等，起到增強(qiáng)機(jī)體免疫力和延緩衰老的作用。

目前已有文獻(xiàn)研究不同干燥方法對(duì)金銀花中某種活性成分的影響［6］，但是對(duì)于不同干燥方法對(duì)金銀花提取物的抗氧活性和總酚、總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響研究很少。本實(shí)驗(yàn)采用操作簡(jiǎn)單、快捷靈敏的化學(xué)發(fā)光法［7］，利用魯米諾化學(xué)發(fā)光體系探討了不同干燥方法對(duì)金銀花的抗氧化活性以及其中的總酚和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，為金銀花資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究提供了理論依據(jù)。

1 儀器與材料

儀器:MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司);722E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);GZX-9140數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海宏博實(shí)業(yè)有限公司);YZWZ-3型微波干燥箱3kW(南京研正微波設(shè)備廠);SB-5200D型超聲波清洗機(jī)30 kHz(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

金銀花于2012年7月采于山東濟(jì)南平陰基地。

試劑:0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，使用前新鮮配制，調(diào)節(jié)至pH=10.2;魯米諾(Luminol)溶液，用pH=10.2，濃度為0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配置成0.2 mmol/L，避光保存;鄰苯三酚溶液，用1 mmol/L的HCl溶液配置成10mmol/L;FeSO4溶液，先用1mL的0.5 mol/L的H2SO4溶液將FeSO4晶體溶解，然后用水稀釋至0.5 mmol/L;H2O2溶液，用水將H2O2配置為體積分?jǐn)?shù)為0.6%和0.06%的溶液;抗壞血酸溶液，精確取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品2.48mg，用二次蒸餾水溶解配制成0.248mg/mL，然后用二次蒸餾水依次稀釋為 0.0248、0.00496、0.00248、0.00124、0.000496、0.00031 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 金銀花的干燥和提取

2.1.1 金銀花的干燥

金銀花采用3種不同的干燥方法做比較。(1)微波法:在微波干燥器中加入金銀花鮮樣100 g，設(shè)定微波功率3 kW，溫度70℃，干燥時(shí)間10min，得到干基重22 g。(2)鼓風(fēng)干燥法:在鼓風(fēng)烘箱中加入金銀花鮮樣100 g，設(shè)定溫度為40℃，干燥時(shí)間14 h，得到干基重22 g。(3)晾干法:將100 g金銀花鮮樣在自然條件下晾4 d，得到干基重22 g。

2.1.2 金銀花的提取

取不同方法干燥的金銀花樣品，粉碎，過(guò)40目篩，各樣品分別取1.0 g，以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液按照料液比1:50(g/mL)超聲提取30min，提取液過(guò)濾、離心后，用50%乙醇定容至50mL，得到不同干燥方法的金銀花提取液。

2.2 金銀花提取液化學(xué)成分的測(cè)定

2.2.1 總黃酮的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［8］，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系測(cè)定金銀花提取液中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以試劑空白為參比，在510 nm處測(cè)定樣品的吸光度值，得到的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)用相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)來(lái)表示，測(cè)3次取平均值。得到線性回歸方程:y=9.54278 ×10－4+0.01042x，R2=0.9996，蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)在 0 ～10 μg/mL時(shí)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 總酚的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［9］，采用Folin酚法對(duì)金銀花提取物中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。以試劑空白為參比，在765 nm處測(cè)定樣品的吸光度值，得到的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)以相當(dāng)于沒(méi)食子酸的毫克數(shù)來(lái)表示，測(cè)3次取平均值。得到回歸方程:y=0.01166+0.11869x，R2=0.9992，沒(méi)食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0 ～74 μg/mL 時(shí)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.3 金銀花提取物抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

采用魯米諾－鄰苯三酚化學(xué)發(fā)光體系［10］，以體積分?jǐn)?shù)7.5% 的乙醇溶液為空白。將3種不同干燥方法的金銀花提取液配制成不同的濃度梯度(1%、3%、5%、10%、15%，乙醇體積分?jǐn)?shù)均為7.5%)，陽(yáng)性對(duì)照組為抗壞血酸溶液配制成不同的濃度(0.0248、0.00496、0.00248、0.00124、0.000496、0.00031 mg/mL)，打開(kāi)反應(yīng)池與光電倍增管的連接開(kāi)關(guān)，將光電倍增管高壓設(shè)置在800 V，在樣品池中依次加入魯米諾溶液4 mL、樣品(或空白)溶液0.5 mL、鄰苯三酚溶液0.4 mL，立即啟動(dòng)儀器，記錄其在400 s內(nèi)的發(fā)光積分強(qiáng)度。以空白的發(fā)光強(qiáng)度作為本底發(fā)光強(qiáng)度I0，以抗壞血酸溶液做陽(yáng)性對(duì)照。以清除率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算清除率在50%時(shí)的濃度IC50，平行測(cè)定3次取平均值。

2.3.2 H2O2清除率的測(cè)定

采用魯米諾－H2O2化學(xué)發(fā)光體系［11］，以體積分?jǐn)?shù)5%的乙醇溶液為空白。將3種不同干燥方法的金銀花提取液配制成不同的濃度梯度(0.02%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%、5%、10%，乙醇體積分?jǐn)?shù)均為5%)，陽(yáng)性對(duì)照為抗壞血酸溶液，濃度同2.3.1，打開(kāi)反應(yīng)池與光電倍增管的連接開(kāi)關(guān)，將光電倍增管高壓設(shè)置在600 V，在樣品池中依次加入魯米諾溶液4 mL、樣品(或空白)溶液0.5 mL、H2O2溶液0.2 mL，立即啟動(dòng)儀器，記錄其在200 s內(nèi)的發(fā)光積分強(qiáng)度。以空白的發(fā)光強(qiáng)度作為本底發(fā)光強(qiáng)度I0，以抗壞血酸溶液做陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算其IC50。平行測(cè)定3次取平均值。

2.3.3 HO·清除率的測(cè)定

采用魯米諾-FeSO4-H2O2化學(xué)發(fā)光體系［12］，以體積分?jǐn)?shù)5%的乙醇溶液為空白。將3種不同干燥方法的金銀花提取液配制成不同的濃度梯度(0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%、5%、10%，乙醇體積分?jǐn)?shù)均為5%)，陽(yáng)性對(duì)照為抗壞血酸溶液，濃度同2.3.1，打開(kāi)反應(yīng)池與光電倍增管的連接開(kāi)關(guān)，將光電倍增管高壓設(shè)置在800 V，在樣品池中依次加入魯米諾溶液4 mL、樣品(或空白)溶液0.5 mL、FeSO4溶液0.2 mL、H2O2溶液0.2 mL，立即啟動(dòng)儀器，記錄其在400 s內(nèi)的發(fā)光積分強(qiáng)度。以空白的發(fā)光強(qiáng)度作為本底發(fā)光強(qiáng)度I0，以抗壞血酸溶液做陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算其IC50。平行測(cè)定3次取平均值。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，用Origin 6.0軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)算所得曲線的積分面積為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算清除率用如下公式:

其中I0表示不加樣品時(shí)的空白發(fā)光強(qiáng)度，I表示加入金銀花提取物樣品時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度。

所得清除率曲線，采用Origin 6.0軟件進(jìn)行Sigmoidal擬合，擬合公式為

其中y為清除率，x為提取物濃度，當(dāng)y=50%時(shí)對(duì)應(yīng)的x即為IC50。式中A1，A2，x0和p對(duì)應(yīng)的值如表1所示。

表1 公式(2)參數(shù)數(shù)值Table 1 Parameter values of formula(2)

3 結(jié)果與討論

3.1 不同干燥方法處理的金銀花提取液中的總酚、總黃酮

不同干燥方法處理的金銀花提取液中的總黃酮和總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表2所示。其中在70℃微波干燥10min條件時(shí)，金銀花提取液中的總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為30.40±2.75 mg/g和61.24±7.62 mg/g，而在自然陰干4 d的條件下，金銀花提取液中的總酚和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，分別為10.22±0.81 mg/g和17.50±2.28mg/g。由此可以得出，微波干燥的方法快捷且總酚、總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

表2 不同干燥方法處理的金銀花提取物的IC50及其總酚總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 IC50and the content of total phnolic and total flavonoid of honeysuckle extracts by different drying methods

3.2 金銀花提取物對(duì)O－2的清除作用

魯米諾－鄰苯三酚化學(xué)發(fā)光體系的原理［10］為:以魯米諾為發(fā)光劑，鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生的將魯米諾過(guò)氧化，使產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)中間產(chǎn)物返回到基態(tài)而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，并且其發(fā)光強(qiáng)度與在一定強(qiáng)度范圍內(nèi)成線性關(guān)系。加入金銀花提取物后，由于其含有豐富的黃酮類和多酚類化合物，其結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，可以提供活潑氫，從而阻斷了該體系中自由基的反應(yīng)，抑制了其化學(xué)發(fā)光。

3.3 金銀花提取物對(duì)H2O2的清除作用

H2O2將化學(xué)發(fā)光劑魯米諾過(guò)氧化，產(chǎn)生電子激發(fā)態(tài)中間產(chǎn)物，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，可集中釋放光子，發(fā)出化學(xué)冷光［13］，且其化學(xué)強(qiáng)度與H2O2的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中，加入金銀花提取物后，由于其中含有豐富的黃酮類化合物和多酚類化合物，具有較強(qiáng)的還原性，阻斷了該體系的反應(yīng)，抑制了其化學(xué)發(fā)光。

圖2顯示，3種干燥方法處理的金銀花對(duì)H2O2的清除率的IC50分別為微波＜鼓風(fēng)干燥＜陰干，這與表2中的總酚和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。因此，可以得出微波干燥處理的金銀花提取液的總酚和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，去除H2O2的能力最強(qiáng)，清除H2O2的IC50相當(dāng)于0.0019 mg/mL的抗壞血酸溶液。

3.4 金銀花提取物對(duì)HO·的清除作用

由Fenton試劑中的Fe2+和H2O2反應(yīng)生成羥基自由基，魯米諾作為發(fā)光增效劑與HO·發(fā)生反應(yīng)，發(fā)出化學(xué)冷光，并且其發(fā)光強(qiáng)度與HO·在一定強(qiáng)度范圍內(nèi)成線性關(guān)系。當(dāng)加入金銀花提取物之后，由于其中含有大量的黃酮和多酚，將Fe2+氧化為Fe3+，阻斷了該體系的反應(yīng)，抑制了其化學(xué)發(fā)光。

圖3顯示，3種干燥方法處理的金銀花對(duì)HO·的清除率的IC50分別為微波＜鼓風(fēng)干燥＜陰干，這與表2中的總酚和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。因此，微波干燥處理的金銀花提取液的總酚和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其去除HO·的能力最強(qiáng)，清除HO·的IC50相當(dāng)于0.0013 mg/mL的抗壞血酸溶液。

圖3 不同干燥方法處理的金銀花提取物的HO·的清除作用Fig.3 Scavenging activity of hydroxyl free radical of honeysuckle extracts by different drying methods

4 結(jié)論

金銀花含有大量的酚類和黃酮類化合物，并且具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且抗氧化活性與提取液的濃度呈正相關(guān)。不同干燥方法對(duì)金銀花活性物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗氧化活性有較大的影響，其中微波干燥的時(shí)間最短，總酚和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為30.40 ±2.75 mg/g、61.24 ±7.62 mg/g，并且抗氧化活性最強(qiáng);鼓風(fēng)干燥次之;而自然陰干的時(shí)間最長(zhǎng)，總酚和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，分別為10.22±0.81 mg/g、17.50±2.28mg/g，且抗氧化活性最弱。這表明，過(guò)長(zhǎng)的干燥時(shí)間會(huì)導(dǎo)致活性物質(zhì)的流失，不利于保持金銀花的活性成分。

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