重組人促性腺激素－銅綠假單胞菌外毒素A蛋白的可溶性表達、純化和對腫瘤細胞的抑制活性

郭凱，趙曉燕，周紅姿，陳凱，李紀順，陳泉，楊合同

(山東省科學院中日友好生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014)

導向治療是一種有望代替化療的新的治療手段，應用免疫毒素或導向毒素是實現導向治療的一個重要的發展方向，通過特異性抗體或細胞因子、激素等與毒素連接，前者作為導向部分即配體，可以引導分子到達腫瘤部位并與腫瘤細胞表面過量表達的該種受體結合;后者作為毒素部分，即殺滅腫瘤細胞的部分。部分免疫毒素，如 OVB3－PE、IgG－HD37－dgA、IgG－RFB4－dgA、B3－PE40、LHRH－PE40 等已進入臨床觀察，DAB389－IL－2(商品名為ONTAC)已通過FDA批準上市，顯示出良好的療效［1］。

綠膿桿菌外毒素A屬于單轉移酶家族，將NAD+的ADP－核糖基轉移至底物使其ADP－核糖化［2－3］。綠膿桿菌外毒素A(PEA)的分子量為66.0 kD，主要功能結構域包括:Domain Ia(AA 1－252)，與受體識別的結合的結構域;Domain Ib(AA 365－484);Domain II(AA 253－364)，Domain II與毒素從細胞膜外到細胞內的跨膜轉運相關;Domain III(AA 405－613)，Domain III和Ib共同組成催化ADP－核糖化的催化結構域。在真核細胞內，綠膿桿菌外毒素A催化蛋白質延長因子eEF－2ADP，使其發生核糖基化作用從而喪失活性，最終阻斷細胞內的蛋白質合成，導致細胞的死亡［2－3］。

人促性腺激素釋放激素(GnRH)做為重組蛋白的導向部分，能夠和癌細胞表面表達的GnRH受體特異性結合。大量實驗表明，GnRH受體在某些癌細胞表面高度表達，而相應的正常細胞表面該受體幾乎不表達［4－5］。

有文獻報道PE毒素的AA 359－365缺失后，PE的活性會大幅度提高［6］;此外，將PE末端5個氨基酸REDLK突變為KDEL后，也會使其活性大幅度提高［7］。所以本文選取PEA衍生物PE39KDEL作為靶向抗腫瘤蛋白的毒素部分。

目前文獻報道的PEA衍生物的相關基因工程蛋白中，都是以包涵體形式表達［8－9］，純化后需要進行蛋白質復性操作，然而蛋白質的復性過程較為繁瑣，且無法保證蛋白質的天然活性構象［10－11］。本文通過表達載體的構建和后期表達優化，最終得到可溶性表達的蛋白GnRH－PE39KDEL前體，經一步純化后蛋白純度達到95%以上，蛋白最終得率在2.6 mg/g菌體，解決了GnRH－PE39KDEL重組蛋白無法可溶表達的難題，為進一步工業化生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和BL21(DE3)plysS為本實驗室保存菌種，質粒pET－24b購自Navogen公司，基因GnRH－PE39KDEL和相關引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。

1.1.2 試劑

Pfu Taq DNA聚合酶購自天為時代;限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶及DNA Marker購自TaKaRa公司;IPTG購自羅氏;蛋白質中等分子量marker、卡那霉素、凝膠電泳回收試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司;HisTrap HP(通用電器生命科學部);其它為國產分析純試劑。

1.1.3 儀器

PCR儀:Bio－Rad MyCycler溫度梯度PCR儀。

電泳及成像:Bio－Rad和G－BOX紫外凝膠成像系統。

蛋白質純化及電泳:GE公司的AKTA purifier親和層析系統，Bio－Rad SDS－PAGE垂直電泳系統。

1.2 方法

1.2.1 GnRH－PE39KDEL 基因的獲得

依據大腸桿菌密碼子偏好性優化GnRH－PE39KDEL核酸序列，通過基因合成的方法，獲得全長序列，由上海鼎國生物技術有限公司合成。

1.2.2 pET－24b－GnRH－PE39KDEL 載體的構建和鑒定

含GnRH－PE39KDEL全長的Puc57的DH5α大腸桿菌經質粒回收試劑盒提取完整質粒作為PCR模板。設計的正向引物含有蛋氨酸起始密碼子及 NdeI酶切位點，pET－24bForward:5′－ggaattc CATATGGAACACTGGTCTTACGGTC;反相引物中引入Factor Xa蛋白酶切割位點及EcoR I酶切位點，pET－24b Reverse:5″－ccgGAATTCGCGACCTTCCACCAGTTCGTCTTTCGGCGG。用Nde I和EcoR I限制性內切酶雙酶切PCR－GnRH－PE39KDEL回收產物和質粒pET－24b，兩者按摩爾比5:1混勻，使用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。連接產物1 μL轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布于含卡那霉素的瓊脂糖平板上，37℃培養過夜，挑取單克隆搖菌，提取質粒比較重組DNA分子量大小，限制性內切酶、PCR鑒定后進行重組質粒的測序，將陽性克隆命名為 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－DH5α。

1.2.3 pET－24b－GnRH－PE39KDEL表達載體轉化及在不同大腸桿菌中誘導表達條件的優化

將鑒定后的 pET－24b－GnRH－PE39KDEL表達載體轉入制備好的感受態細胞株 BL21(DE3)和 BL21(DE3)plysS 中，分別記為 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－DE3 和 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－plysS。

誘導溫度、誘導劑濃度及誘導時間:挑取 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－DE3單菌落于 20mL含有100 μmol/L卡那霉素的LB+0.2 mg/mL葡萄糖液體培養基，37℃ 180 r/min過夜培養，按4%的接菌量轉接至50mL含有100 μmol/L卡那霉素的LB+0.2 mg/mL葡萄糖培養基中，37℃ 180 r/min，繼續培養3 h至 OD600為 0.6，加入異丙基－β－D－硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度 0、0.1、0.2、0.4、0.8mmol/L，分成 2 組，分別于30℃、37℃ 180 r/min培養5 h，每1 h取樣一次。菌液12000 g離心2 min，使用1×loading buffer重懸菌體，99℃保溫4 min，12000g離心2 min后－20℃保存待用。

宿主菌優化:挑取 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－DE3 和 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－plysS 單菌落于 20mL含有100 μmol/L卡那霉素的LB+0.2% 葡萄糖液體培養基，37℃ 180 r/min過夜培養，按4%的接菌量轉接至50mL含有100μmol/L卡那霉素的LB+0.2 mg/mL葡萄糖培養基中，37℃ 180 r/min，繼續培養3 h至OD600為0.6，IPTG至終濃度0.2 mmol/L，分成2組，于30℃ 180 r/min培養5 h，每 1 h取樣一次。菌液12000 g離心2 min，使用1×loading buffer重懸菌體，99℃保溫4 min，12000g離心2 min后－20℃保存待用。

1.2.4 變性 SDS－PAGE 電泳分析

配制12 mg/mL的分離膠和5 mg/mL濃縮膠，進行SDS－PAGE電泳分析蛋白表達。

1.2.5 GnRH－PE39KDEL融合蛋白的大量表達和初純品的制備

接種單克隆 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－plysS 含有100 μmol/L 卡那霉素的 LB+0.2 mg/mL 葡萄糖液體培養基中37℃ 180 r/min過夜培養，按5(V/V)接菌量接種種子液至500mL含有100 μmol/L卡那霉素的LB+0.2 mg/mL葡萄糖液體培養基中，約2.5 h OD600升為0.6時，降溫至30℃ 加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L，誘導重組蛋白表達2 h，高速離心收集菌體，按照菌體和破碎緩沖液(50mmol/L Tris pH=8.0，0.5 mol/L NaCl，5%Glycerol，20mmol/L Imidazole)1:5(V/V)的比例重懸菌體，超聲波破碎，高速離心后收集上清。加入1 μg/mL DNase和RNase及1 mmol/L MgCl2，經0.22 μm 過濾膜過濾。

利用GE AKTA purifier系統平衡層析柱后，使用上樣泵將樣品加載入親和層析柱上(流速≤4 mL/min，柱壓≤0.3 MPa)。使用上樣緩沖液(50mmol/L Tris pH=8.0，0.5 mol/L NaCl)沖洗層析柱至 UV280達到平衡。調節洗脫緩沖液(50mmol/L Tris pH=8.0，0.5 mol/L NaCl，500mmol/L Imidazole)的體積至 10%(50mmol/L Imidazole)，洗脫結合在層析柱中的雜蛋白，設定UV280≥100收集。提高洗脫緩沖液體積比至50%(250mmol/L Imidazole)，最后使用100%(V/V)洗脫緩沖液清洗層析柱［12－13］。層析柱平衡后保存至緩沖液中，將各組分進行SDS電泳分析。

1.2.6 活性檢測

收集對數期細胞A549，調整細胞懸液濃度，每孔加入200 μL，鋪板使待測細胞調密度至103～104個/孔。體積分數為5%的CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物，孵育16～48 h。每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h。終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10min。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。

2 結果

2.1 pET－24b－GnRH－PE39KDEL 重組表達載體質粒的鑒定

使用單克隆菌落回收的質粒經 PCR、單酶切、雙酶切結果證實(圖1)，在pET－24b－GnRH－PE39KDEL載體中含有正確插入的重組蛋白核酸序列。

瓊脂糖電泳結果顯示在1.2 kb處有特異目的條帶，提取重組質粒后使用BamHI、EcoRI進行雙酶切，在5.3 kb和1.2 kb處獲得2個片段。經生工生物工程(上海)有限公司正反向測序后，核酸序列與合成的重組蛋白核酸序列一致。

圖1 重組質粒pET－24b－GnRH－PE39KDEL構建的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoretic analysis of colony PCR products enzymatic digestion

2.2 pET－24b－GnRH－PE39KDEL表達產物的初步鑒定及表達條件的優化

融合蛋白表達含有395個氨基酸殘基，理論分子量為42.8 kD。重組菌株中總蛋白經SDS－PAGE電泳顯示在35～45 kD處有一明顯的目的條帶，同時在0.2 mmol/L IPTG誘導濃度下，蛋白表達達到最大值，增加IPTG并未增加誘導蛋白表達量(數據未列出)。在溫度誘導條件下，37℃蛋白表達量較30℃明顯增高，但是為包涵體表達形式，30℃時蛋白以可溶形式表達。故使用30℃進行重組蛋白大量生產。在IPTG誘導下，重組蛋白在BL21(DE3)plysS中2 h達到最大表達量，而在BL21(DE3)此過程需要4 h(圖2)。BL21(DE3)plysS帶有的pLysS質粒編碼T7噬菌體溶菌酶，可以極大或完全抑制誘導劑(IPTG)加入前的重組蛋白的非誘導表達，而重組蛋白在菌體生長中的痕量表達有可能對IPTG誘導的蛋白過程起到一定的反饋抑制作用，這可能是BL21(DE3)plysS表達重組蛋白速度更快的原因。

使用Image Pro Plus對SDS－PAGE的結果分析顯示，重組蛋白表達量占總蛋白的30%(w/w)左右，占可溶蛋白的40%(w/w)以上。

圖2 pET－24b－GnRH－PE39KDEL 在 E.coli BL21(DE3)和 E.coli BL21(DE3)plysS 重組 SDS－PAGE電泳圖Fig.2 SDS－PAGE analysis of recombinant protein of pET－24b－GnRH－PE39KDEL in E.coli BL21(DE3)and E.coli BL21(DE3)plysS

2.3 重組蛋白純品的制備

經過HisTrap親和層析柱純化得到的蛋白純度約為90%，使用脫鹽柱緩沖液置換后，去除了小分子量的蛋白和一些線性蛋白，蛋白純度達到95%以上，見圖3。蛋白純化過程中存在一些可以和鎳柱親和吸附的宿主菌蛋白，在圖3中可見在25～30 kD有宿主蛋白條帶。在后續的純化過程中，這些非特異性吸附蛋白被去除掉(數據未列出)。

圖3 重組蛋白純化過程與SDS－PAGE電泳結果Fig.3 Purification of recombinant protein GnRH－PE39KDEL

2.4 質譜鑒定重組蛋白氨基酸序列

取蛋白樣品 200 μg，溶于 50 μL 含有 8mol/L urea、10mmol/L DTT、50mmol/L NH4HCO3的溶液中，置37°C水浴中還原4 h，然后加入5 μL 0.5 mol/L碘乙酰胺放置暗處1 h進行烷基化，加250 μL 50mmol/L NH4HCO3溶液將尿素稀釋到1 mol/L以下，最后加入5 μg的胰蛋白酶37℃保溫反應16 h，取出后冷凍干燥成粉末，用流動相(體積分數0.1%的甲酸水溶液)復溶至200 μL待測。

使用Agilent串聯快速分離液相－6520型四極桿飛行時間質譜(RRLC－Q－TOF)鑒定，肽段和數據庫比較得出，此蛋白含有正確的PEA66蛋白序列。由于重組蛋白是一種毒性蛋白，在大腸桿菌中是否表達，是否表達全長序列需要檢測。通過質譜分析并結合SDS電泳分析發現，在宿主菌中重組蛋白得以表達并且可以全長正確表達，結果圖4所示。

2.5 重組蛋白對腫瘤細胞A549的增值抑制效果

本實驗室前期得到的包涵體蛋白復性后的活性檢測結果表明，包涵體復性蛋白活性明顯低于可溶性表達的重組蛋白。同時包涵體復性過程不僅增加了操作步驟和生產成本，同時由于操作步驟過多降低了蛋白的得率。

實驗結果(圖5)顯示可溶性表達重組蛋白對于肺癌細胞株A549的增殖有很好的抑制作用，經計算IC50所需要的重組蛋白濃度為 20.70 μg/mL，相對應的包涵體復性蛋白濃度為192.42 μg/mL。由此可見可溶性表達的重組蛋白具有很好的抑制腫瘤細胞增殖的作用。

2.6 討論

目前以GnRH或其衍生物為導向部分，以綠膿桿菌外毒素A(PE)的截短形式及其衍生物為毒素部分的靶向治療劑已經有報道［14］。這種靶向治療劑是利用GnRH受體在某些腫瘤細胞表面過量表達的現象，用融合蛋白中的GnRH部分與過度表達GnRH受體的腫瘤細胞表面的LHRH受體產生特異性的結合，然后將其毒素部分PE衍生物導入腫瘤細胞，同時對正常細胞作用較少或無影響。與傳統的腫瘤治療方法相比GnRH－PE衍生物的靶向性治療以其特異性和高效性而占有無可爭辯的優勢［15－17］。

在已有的PE類衍生物的重組蛋白報道中，重組蛋白以包涵體形式表達，這為后期蛋白復性和工業化生產帶來很多問題。本研究構建的pET－24b－GnRH－PE39KDEL－BL21(DE3)plysS能夠實現重組蛋白的可溶性表達，在對重組蛋白表達條件進行初步優化后，利用AKTA purifier系統可以獲得純度達95%以上的目的蛋白，蛋白最終得率在2.6 mg/g菌體。并且通過IC50檢測，證實了前體蛋白良好的毒殺腫瘤細胞活性。

本實驗通過工程菌株的篩選和優化表達純化工藝，得到了一套較為成熟和簡便的GnRH－PE39KDEL純化流程，為后續工業放大生產奠定了可靠的基礎。

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