浙江清涼峰地衣內生菌物種多樣性及活性研究

劉靜，胡玲，王海英，趙遵田

(山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014)

地衣(Iichens)是真菌和藻類的共生復合體，地衣內生菌可產生對多種病原菌具抑制活性的次生代謝產物，因此，許多地衣學家期望能通過人工培養手段盡快獲得足夠生物量的地衣內生菌及其代謝產物，為研究其活性及化學特性提供豐富的原材料。目前，幾乎都是通過Yamamoto法［1］分離地衣內生菌，然而該方法污染率非常高，因此，我們采用刮皮層挑取菌絲的新方法以較高效地獲得目標內生菌［2］。

對浙江省清涼峰10m×10m樣方采集的地衣體標本進行分離培養，得到的55株地衣內生菌進行ITS序列和28S序列的分子鑒定，并通過GenBank數據庫搜索，ClastalX 2.11多重序列比對以及MEGA 5.0最小進化法(ME)構建系統發育樹［3］，得知該地區地衣內生菌的物種多樣性［4］。

該研究對55株地衣內生菌的次生代謝產物進行活性初篩，利用濾紙片法［5］檢測其次生代謝產物的抗細菌、真菌活性。結果表明，其代謝產物具較強的抗細菌、白色念珠菌的生物活性，具抑菌活性的菌株占所測總菌株的14.55%。地衣內生菌產生的各種活性物質在生物制藥、農業生產、工業發酵等方面都表現出很好的應用前景［6］，受到世界各國專家的廣泛關注。

1 材料與方法

1.1 材料

從分離培養的82株地衣內生菌中選取菌落的形態、顏色差異較大的55株作為受試菌株。

1.2 方法

對55株受試菌株進行ITS序列和28S序列測定［7］。

1.2.1 地衣內生菌的分子鑒定

采用CTAB法［8］提取內生菌總DNA，然后進行ITS序列和28S序列的擴增，ITS序列所用引物為E9:5′－TTGTACACACCGCCCGT－3′;CL2R:5′－TTTCTTTTCCTCCGCT TTATTGA－3′，28S 序 列 所 用 引 物 為 L1:5′－ACCCGCTGAACTTAAGCATA－3′;CL6R:5′－TGCTACTACCACCAAGATC－3′。擴增條件［9］為:95℃ 預變性3 min，94℃變性30 s;52℃復性30 s，72℃延伸30 s，共37個循環，72℃后延伸10min，4℃保存。擴增的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測之后進行測序。

1.2.2 地衣內生菌的活性初篩

1.2.2.1 培養基［10－12］

(1)PDA培養基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、去離子水1000mL、pH值7.0;

(2)LB 培養基:蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、去離子水1000mL、pH 值7.4。

1.2.2.2 拮抗實驗菌株

(1)供試細菌:大腸桿菌(Escherichia coli DH5αi)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum);

(2)供試真菌:白色念珠菌(Monilia albican)。

1.2.2.3 抗生素

氨芐青霉素(Ampicillin)、鹽酸四環素(Tetracycline hydrochloride)。

1.2.2.4 內生真菌發酵及代謝產物的提取

分離到的地衣內生菌斜面培養物經活化后分別接種至200mL PDA發酵培養基中，22℃搖床上以110 r/min的轉速培養21 d，發酵結束后將發酵物用乙醇超聲30min后浸泡抽提1 d，旋蒸后的浸膏用乙酸乙酯萃取1 d，用2 mL甲醇將旋蒸干后的粗提物0.5 g溶解，配成0.25 g/mL的濃縮液［13］。

1.2.2.5 內生真菌代謝物抗細菌、抗真菌活性檢測

采用濾紙片法進行抗菌活性檢測:活化后的細菌培養液用無菌水稀釋成105 cfu/mL的菌懸液［14］，取0.1mL菌懸液涂布于LB平板上。將無菌小濾紙片(直徑為6 mm，高溫蒸汽殺菌后烘干)浸泡在濃度為10mg/mL粗提液中約30min，瀝干貼于含菌平板上，以浸有0.1 mg/mL氨芐青霉素的濾紙片為陽性對照，以浸有甲醇的濾紙片為陰性對照，37℃培養24 h，觀察抑菌圈的大小及有無。吸取200 μL白色念珠菌的稀釋液(105cfu/mL)涂布于PDA平板上，28℃培養48 h，其余均與細菌相同，并用空白濾紙片吸取甲醇溶液作為陰性對照;用浸泡過鹽酸四環素的濾紙片晾干后貼于平板上作為陽性對照，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，設置3個重復。

2 結果

2.1 菌株的分類學地位

對獲得的ITS序列和28S序列通過GenBank數據庫搜索，ClastalX 2.11多重序列比對以及MEGA 5.0最小進化法(ME)構建系統發育樹，得到所有菌株的分類學地位如下:3個綱:即 Dothideomycetes、Tremellomycetes、Elaphocordyceps;6 個目:Pleosporales、Hypocreales、Chaetothyriales 、Myriangiales、Dothideales、Capnodiales;10 個 科:Nectriaceae、Herpotrichiellaceae、Teratosphaeriaceae、Massarinaceae、Pleosporaceae、Capnodiaceae、Montagnulaceae、Bionectriaceae、Xylariaceae、Dothideomycetes。

2.2 菌株次生代謝產物的抗菌活性

受試菌株中有4株抗白色念珠菌的活性很強，抑菌圈的最大直徑達到3.0 cm，另外還有5株具較好的抗細菌活性，抑菌圈直徑達到2.0 cm左右，菌株4734a的抗細菌和白色念珠菌活性都較強(見圖1)。所有菌株對金黃色葡萄球菌均無明顯抑制作用，抑菌活性較好的菌株數共8株，占總菌株的14.55%。8株地衣內生菌的抑菌活性照片見圖1～3，抑菌效果見表1。

表1 8株地衣內生菌次生代謝產物的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effect of secondary metabolites of eight endolichenic fungi

3 討論

通過GenBank的相似性搜索和系統發育分析，確定了浙江省清涼峰該實驗樣方內地衣內生菌均屬于子囊菌門。Hartmann等［15］的研究表明，利用多樣性指數分析復雜微生物群落結構是非常有利的。本文采用Shannon－Weiner指數 (H′)=來描述地衣內生菌的物種多樣性，得出該樣方總的內生菌群落生物多樣性指數為1.44，均勻度為0.25。數據分析顯示，該實驗樣方內的地衣內生菌群落顯示出了較豐富的生物多樣性(1.44)，且通過GenBank的相似性搜索得知該內生菌菌群多為未知菌群，充分地顯示了該地衣內生菌是一個非常獨特的微生物新類群，對該地區生態系統的群落研究具有一定的價值和意義。

抗菌活性研究結果顯示，該樣方內地衣內生菌的抗菌活性菌株占總菌株數的14.55%，且抗菌活性較強。本實驗只是初步定性地研究了清涼峰的地衣內生菌次生代謝產物的抗細菌、真菌活性，對其抗菌活性的定量研究需要做進一步的分析，同時也應該研究其抵抗植物病原菌、抗腫瘤、抗病毒以及抗氧化能力，并通過化學的方法將活性較強的單體化合物分離提取出來［16］。總之，作為一種新型的植物研究資源，地衣內生菌的深入研究對新藥的開發具有潛在的應用價值，為人們尋找各種具有較強生物活性的先導化合物開辟了新途徑，從而可以使某些珍稀但瀕臨滅絕的高等藥用植物得到進一步的保護。

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