液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉和豬尿中巴氯芬

許秀琴 吳銀良 楊挺 朱勇 趙健 葉宇飛

摘 要：樣品中的巴氯芬用0.01mol/L HCl溶液提取，提取液經(jīng)WCX柱凈化、富集后，進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS-MS）分析。分析時(shí)采用BEH C18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm），以0.10%甲酸水/甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧正電子（ESI+）模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測，內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果表明：巴氯芬標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0～100.0μg/L范圍內(nèi)，峰面積與含量呈線性相關(guān)。豬肉和豬尿中巴氯芬檢出限分別為0.30μg/kg和0.10μg/L，兩種樣品中添加回收率在85%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于10%。

關(guān)鍵詞：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；巴氯芬；豬肉；豬尿

Determination of Baclofen in Pork and Swine Urine by Liquid Chromatograpy Tandem Mass Spectrometry

XU Xiu-qing，WU Yin-liang*，YANG Ting，ZHU Yong，ZHAO Jian，YE Yu-fei

（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China）

Abstract：A simple and sensitive LC-MS/MS method for the determination of baclofen in pork and swine urine was developed. Samples were extracted with 0.01 mol/L HCl solution， purified with a WCX cartridge and analyzed by LC/MS-MS on a Waters

Acquity BEH C18 column with 0.10% formic acid in water/methanol as the mobile phase by means of gradient elution. Detection was carried out with an electrospray ionisation （ESI） probe and operated in the positive ion mode. Baclofen was quantified by the internal standard method. There was a good linearity in the range of concentrations between 1.0 and 100.0 μg/L. The limits of detection for baclofen were 0.30 μg/kg and 0.10 μg/L in pork and swine urine， respectively. The recoveries from spiked samples were in the range of 85% to 110% and the relative standard deviations were lower than 10%. These results showed that the method was simple， rapid， sensitive and reliable for monitoring residual baclofen in pork and swine urine.

Key words：LC-MS/MS；baclofen；pork；swine urine

中圖分類號：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）09-0022-04

巴氯芬（baclofen），商品名力奧來素（lioresal），化學(xué)名β-4-氯-苯基-γ-氨基丁酸，是γ-氨基丁酸的取代衍生物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)，通過與其3個(gè)特異性受體GABA-A、GABA-B、GABA-C相互作用而發(fā)揮重要的生理活性。巴氯芬是第1個(gè)應(yīng)用于臨床的選擇性GABA-B受體激動(dòng)劑，曾作為肌松藥用于臨床[1]。在動(dòng)物上使用，可以達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長、調(diào)節(jié)食欲、抗應(yīng)激的作用[2]。但是，在動(dòng)物飼料或者獸藥中使用此藥，可對人體健康產(chǎn)生一定的危害。有文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]長期食用巴氯芬會(huì)導(dǎo)致嗜睡、眩暈、嘔吐、乏力、低血壓、精神錯(cuò)亂等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致類似腦死亡的癥狀出現(xiàn)。因此，為保護(hù)人們身體健康，有必要建立動(dòng)物源性食品中巴氯芬藥物殘留的定性、定量分析方法。

圖 1 巴氯芬化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Fig.1 The chemical structural formula of baclofen

Sagirli等[6]、Yagi等[7]、Carlsson等[8]應(yīng)用液相色譜法測定了人血及尿液中的加巴噴丁，Miksa等[9]應(yīng)用液相色譜質(zhì)譜法測定了牛血中的巴氯芬和異丙基甲丁雙脲，Goda等[10]應(yīng)用液相色譜質(zhì)譜法測定人血中的巴氯芬的S（+）-和R（-）-對映異構(gòu)體。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS-MS）法作為1種選擇性強(qiáng)靈敏度高的分析手段，已被廣泛的應(yīng)用于測定各種藥物分析和藥物殘留分析[11-24]。目前對于飼料和豬尿中的巴氯芬分析已有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的報(bào)道，如農(nóng)業(yè)部1862號公告中建立了飼料中的巴氯芬LC-MS/MS測定方法[25]，夏駿等[26]建立了固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬尿中巴氯芬的殘留分析方法，但目前對于豬肉中的巴氯芬LC-MS/MS分析方法尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取凈化，建立了豬肉和豬尿中LC-MS/MS分析方法，整個(gè)方法具有簡便、快速、檢出限低、準(zhǔn)確度和精密度好的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉樣品購于寧波市江東家樂福超市，豬尿樣品為農(nóng)業(yè)部“無公害食品行動(dòng)計(jì)劃”湖北抽檢樣品。

巴氯芬（純度>99%）、加巴噴丁-D4標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%） 加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲醇、乙腈（色譜純） 美國默克公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC XevoTM TQ MS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀美國Waters公司；SIGMA3K15離心機(jī) 北京博勵(lì)行有限公司；RT SPE全自動(dòng)固相萃取儀 美國Caliper公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；固相萃取柱Oasis?WCX（3mL，500mg）、Oasis?MCX（3mL，500mg） 美國Waters公司；Cleanert SCX（3mL，500mg） 北京艾杰爾科技有限公司；CNWBOND HC-C18（3mL，200mg） 上海安譜科學(xué)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱取巴氯芬和加巴噴丁-D4標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg，分別用乙腈定容至刻度，即成質(zhì)量濃度100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃條件下保存，保質(zhì)期為6個(gè)月。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

用0.1%甲酸水/甲醇（80：20，V/V）稀釋巴氯芬標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，各標(biāo)準(zhǔn)工作液中加10μg/L加巴噴丁-D4，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 豬尿樣品前處理

吸取豬尿樣品2.0mL，加入100μL質(zhì)量濃度100μg/L的內(nèi)標(biāo)工作液，用0.5mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0后過經(jīng)6mL甲醇和6mL 0.01mol/L HCl溶液活化的WCX柱，樣品全部上樣后，依次用3mL水清洗，3mL 20%甲醇水清洗，抽干后用5mL 2.0mol/L乙酸甲醇溶液洗脫，洗脫液于40℃水浴中氮?dú)獯蹈桑詈笥?mL 0.1%甲酸水/甲醇（80：20，V/V）定容，過0.22μm濾膜后上機(jī)測定。

1.3.2.2 豬肉樣品前處理

稱取豬肉樣品2g。加入100μL質(zhì)量濃度100μg/L的內(nèi)標(biāo)工作液，再加入10mL 0.01mol/L HCl溶液，均質(zhì)1min后振蕩提取30min，再以8000r/min離心5min，收集上清液，加入10mL 0.01mol/L HCl溶液再按上述方法提取，合并2次提取液，混勻。取5mL提取液按1.3.2.1中方法過MCX小柱。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100mm× 2.1mm，1.7μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）（梯度洗脫）；梯度洗脫程序：0～0.5min，20%甲醇；0.5～2.5min，20%～50%甲醇，保持1.0min；3.5～3.6min，50%～20%甲醇；再保持1.4min。流速：0.2mL/min，柱溫：25℃；進(jìn)樣量10μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件優(yōu)化時(shí)采用1000μg/L的巴氯芬和加巴噴丁-D4標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，利用IntelliStart軟件進(jìn)行優(yōu)化。

電離模式：ESI正離子模式；多級反應(yīng)檢測（multiple reaction monitoring，MRM）。毛細(xì)管電壓1.5kV，離子源溫度150℃，去溶劑氣溫度500℃，去溶劑氣流速為1000L/h，碰撞氣流速0.20mL/min，放大倍數(shù)為600。其他條件詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理過程的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

巴氯芬微溶于水，易溶于酸性及堿性水溶液。因此實(shí)驗(yàn)首先豬尿樣品pH值調(diào)至4、5、6、7、8、9后過WCX柱，結(jié)果表明隨著pH值在4～6范圍內(nèi)樣品回收率均較好，且變化不大，但隨著pH值至中性或堿性后，樣品添加回收率迅速下降，因此本實(shí)驗(yàn)對豬尿樣品進(jìn)行酸化處理（pH4.0）后過MCX小柱。同樣豬肉樣品（10μg/kg添加水平）經(jīng)兩種提取溶液（0.01mol/L HCl溶液和50mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH8.0）提取后過MCX小柱，結(jié)果表明兩種溶液處理方式巴氯芬的添加回收率分別為92.1%和0%，因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.01mol/L HCl溶液進(jìn)行提取。

2.1.2 固相萃取小柱的選擇

取豬尿樣品2mL，添加巴氯芬標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加質(zhì)量濃度為10μg/L，然后調(diào)節(jié)豬尿樣品pH值至4.0后過WCX、MCX、SCX、C18小柱，結(jié)果表明巴氯芬經(jīng)前3種小柱處理后的添加回收率分別為95.3%、94.2%、92.3%，而C18小柱的回收率僅有56.7%，本實(shí)驗(yàn)選擇WCX小柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 儀器條件的選擇

巴氯芬和加巴噴丁-D4在電噴霧離子源正離子模式下能獲得較好的電離，而在電噴霧離子源負(fù)離子模式下難以電離，因此本實(shí)驗(yàn)選擇正離子模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)經(jīng)IntelliStart軟件優(yōu)化后，獲得了兩種化合物的最佳質(zhì)譜條件。

在最優(yōu)質(zhì)譜條件后，實(shí)驗(yàn)選擇Acquity HSS T3（2.1mm× 100mm，1.8μm）柱和Acquity BEH C18 （2.1mm×100mm，

1.7μm）柱進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的流動(dòng)相和色譜條件下，巴氯芬在Acquity HSS T3柱上的響應(yīng)明顯低于在Acquity BEH C18柱；同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巴氯芬在甲酸水/乙腈體系中的靈敏度明顯低于在甲酸水/甲醇體系，因此實(shí)驗(yàn)選擇Acquity BEH C18柱和0.1%甲酸水/甲醇體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 方法參數(shù)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

用0.1%甲酸水/甲醇（80：20，V/V）配制各標(biāo)準(zhǔn)工作液經(jīng)LC-MS-MS測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以巴氯芬定量離子對峰面積和內(nèi)標(biāo)離子對峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，其中回歸方程為y=0.2214ρ+0.0117，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

2.3.2 靈敏度

根據(jù)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的結(jié)果，配制相近質(zhì)量濃度的陽性添加樣品，測定其實(shí)際信噪比。以RSN不小于3為檢測限，以RSN不小于10為定量限。結(jié)果表明，豬尿樣品中巴氯芬的檢出限為0.10μg/L，定量限為0.30μg/L；豬肉樣品中巴氯芬的檢出限為0.30μg/kg，定量限為1.0μg/kg。

2.3.3 精密度和回收率

取豬尿樣品和豬肉樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成1.0、2.0、4.0μg/L（kg）的加標(biāo)樣品，按照1.3.2節(jié)步驟進(jìn)行操作，每個(gè)添加水平重復(fù)3次，每次每個(gè)質(zhì)量濃度5個(gè)加標(biāo)樣品進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%，回收率均在85%～110%之間，具體結(jié)果詳見表2、表3。樣品添加圖譜詳見圖2。

b中巴氯芬添加量為4μg/kg。

圖 2 豬肉空白樣品（a）和豬肉添加巴氯芬樣品（b）MRM色譜圖

Fig.2 MRM chromatograms of blank sample （a） and fortified

sample （b） of pork

3 結(jié) 論

建立了豬尿和豬肉樣品中巴氯芬的快速測定LC-MS/MS方法。豬尿樣品經(jīng)酸化后直接進(jìn)行WCX小柱凈化，豬肉樣品經(jīng)0.01mol/L HCl溶液提取后進(jìn)行WCX小柱凈化，洗脫液吹干復(fù)溶后進(jìn)行LC-MS-MS法測定。該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可適用于我國對巴氯芬在動(dòng)物生產(chǎn)中非法使用的監(jiān)控要求。

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