DNA條形碼技術在肉品防欺詐鑒別中的應用

邱德義 胡佳等

摘 要：以DNA條形碼技術鑒別進出口監督抽檢的魚肉等水產制品的種類來源，用以判別其與申報或產品標簽是否相符。分別提取魚肉等樣品的基因組DNA，以目前國際上比較公認的動物線粒體細胞色素氧化酶CO Ⅰ基因通用引物進行PCR擴增。PCR產物經測序分析后，將得到的擴增片段序列與Genbank數據庫進行序列比對，同時提交Barcoding Life DNA條形碼數據庫（BOLD）進行鑒定分析。本批次監督抽檢的16份魚肉、魚丸等水產制品中除1份樣品未能成功獲得魚肉CO Ⅰ PCR擴增外，其余15份樣品均順利得到種類來源鑒定，鑒定結果約有31.25%的樣品與產品標簽標示不符。作為一種簡單、快速、有效的分子鑒定技術，DNA條形碼可以直接應用于魚肉等動物源性食品的種類鑒定。

關鍵詞：DNA條形碼；冷凍魚肉；動物源性食品；種類鑒定

中圖分類號：Q95 文獻標志碼：B 文章編號：1001-8123（2013）04-0040-04

《晏子春秋：內篇雜下第一》中就有“懸牛首賣馬肉”之說，民間也有“掛羊頭賣狗肉”的演繹，其根本內涵就是：表里不一、狡詐欺騙。在商貿領域表現為以次充好，甚至假冒、仿造貴重物品，欺騙消費者從而達到獲取更高非法利益的真實目的。進入2013年，在有著最嚴格食品安全監管制度的歐盟，真實演繹了席卷歐洲列國的牛肉標識欺詐事件。不僅涉及到食品摻假欺詐的商業行為而且涉及到民族和宗教信仰的問題，引起不食用馬肉和豬肉的穆斯林和猶太人的強烈不滿。馬肉也引發食品安全的擔憂，部分馬肉中已檢測出苯基丁氮酮藥物殘留，此藥物經常用于馬類，有助于止痛和退熱，但對人類有害。受“馬肉風波”事件影響，被忽視多年的海鮮產品以次充好現象也再度浮出水面。

摻假造假的判定和標簽制度的有效實施，必須建立在快速、準確的食品物種鑒定的基礎上。對加工食品而言，物種的原始可識別形態特征消失，這使得物種的鑒別變得相對困難。因此，迫切需要一些靈敏、可靠的檢測方法來鑒定動物食品或動物源性加工食品的物種來源。

DNA條形碼技術（Barcoding）是近幾年興起的一種分子生物學新技術，原理是利用基因組DNA中一段標準的或者被公認的基因片段，作為分子靶標來進行種級水平的種類鑒定。DNA條形碼技術對鑒定者的經驗和專業知識背景要求較低，為物種的鑒定提供了新的手段，彌補了傳統分類的諸多不足。但條形碼鑒別技術需要有專門的數據庫作為支撐，含有較全面的生物學信息[1-2]。

利用分子標記進行物種種類鑒定國際上已有不少的嘗試，Hebert等[3-4]于2003年發表了國際上第一篇利用DNA 條形碼進行物種鑒定的論文，隨后Ball等[5]嘗試用分子條形碼鑒別了70多種水生蜉蝣，游中華等[6]用線粒體CO I鑒別了入侵害蟲西花薊馬及其他8種常見薊馬；岳巧云等[7-8]將DNA條形碼技術應用于出入境檢驗檢疫把關，成功對醫學媒介生物進行種類鑒定并建立數據庫。Wong等[9]利用DNA 條形碼技術對市場上的91個海產品樣品進行分析，推斷出可能有25%海產品的標簽與實物不符，認為DNA 條形碼技術是一種經濟的、有效的、可將海產品鑒定到種的分子鑒別技術。在我國，DNA條形碼技術用于食品鑒別的文獻報道較少，常見的動物源成分鑒定技術應用的是特異PCR、熒光PCR等技術，也頒布了一部分行業檢測標準，但其局限性顯而易見。柳淑芳等[10]報道了DNA條形碼技術在魚類系統分類中的應用，為該項技術在魚種類鑒別中的應用前景提供了有力支持。

本實驗室應用線粒體CO Ⅰ片段為靶標，CO Ⅱ、CO III以及ITS等作為備用標靶和確證基因，對進出口監督抽檢及口岸截獲的多批次包括魚肉、魚片、蝦餃、魚丸等水產和水產制品進行檢測鑒定，并通過分析比對進行了確認。龍利魚（Cynoglossus macrolepidotus） 自然資源量少，味道鮮美，為一種高檔海鮮。本實驗將以其中一份申報為龍利魚柳凍魚肉的檢測鑒定作為典型范例，對DNA條形碼技術在進出口檢驗監管方面的應用做一分析和介紹。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究樣本為從各進出口食品企業監督抽檢的多批次包括魚肉、魚片、蝦餃、魚丸、蝦醬等水產和水產制品以及口岸截獲的冷凍魚肉。

動物組織基因組DNA 提取試劑盒、PCR產物及DNA片段回收試劑盒、T4連接試劑盒、DH5α感受態細胞 天根生化科技北京有限公司；EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

Sigma 1-15pk冷凍離心機 德國Sigma公司；S1000梯度PCR儀、Gel DocTM XR+凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；DYCP-31E電泳儀 北京六一儀器廠； NanoDrop 1000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

魚肉基因組DNA提取均采用動物組織基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑盒使用手冊進行基因組DNA提取，對個別魚肉樣品適當延長蛋白酶消解時間。

1.3.2 PCR擴增

PCR擴增所用引物為：LCO1490 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，HCO2198 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3[10-11]，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR反應體系（50?L）：10倍PCR緩沖液5?L；正向引物（20?mol/L）2.5?L；反向引物（20?mol/L）2.5?L；dNTP（10mmol/L）1.5?L；Ex-Taq 1?L；模板DNA 2?L；無菌水定容到50?L。

EX-Taq DNA聚合酶擴增條件：94℃變性5min；94℃、40s，54℃、40s，72℃、1min，反應40個循環；72℃延伸10min。

PCR 擴增完成后，經1%瓊脂糖凝膠進行電泳分離后，使用數碼凝膠成像系統分析擴增產物。

1.3.3 PCR產物測序

PCR產物直接測序時，將獲得的PCR產物按照瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明書的操作步驟割膠純化，送深圳華大基因有限公司進行雙向測序，測序引物同于擴增引物。所得的測序結果經拼接并刪除兩端引物序列，獲得最終的擴增序列。

1.3.4 PCR產物克隆測序

克隆測序用于驗證PCR產物測序結果的準確性，尤其針對多成分肉制品的PCR產物采用挑選不同陽性克隆進行測序分析。對PCR產物進行純化，隨后按T-vector試劑盒推薦反應體系與pGEM-T載體連接，導入DH5α感受態細胞中，36℃培養過夜，經過藍-白斑篩選后，挑取3～10個不同的白色單菌落進行菌落PCR驗證。陽性克隆菌落接種到LB液體培養基（含有100μg/mL氨芐青霉素）中，在36℃、180r/min搖床上培養過夜，吸取菌液1mL抽提質粒DNA，并送深圳華大基因進行測序。測序引物采用T7通用測序引物。

1.3.5 擴增序列分析比對

PCR產物直接測序或克隆測序后，去除擴增引物序列，提交GenBank進行BLAST比對[12]，并使用BOLD網站[13]的數據庫對樣品的CO I序列進行鑒定以及相似度分析。

2 結果與分析

2.1 線粒體CO Ⅰ基因片段的擴增

以動物基因組DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA后，應用CO Ⅰ通用引物進行PCR擴增，擴增產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，冷凍魚、魚丸、蝦餃、蝦醬等水產品的CO Ⅰ序列可以用通用引物擴增出來，說明通用引物的通用性高，可用于魚肉中CO Ⅰ基因的擴增。圖1顯示的是申報為龍利魚柳冷凍魚肉的CO Ⅰ、CO Ⅱ、ITS擴增及一份魚丸樣品的CO I序列擴增。

2.2 冷凍魚柳CO Ⅰ測序結果分析

對龍利魚柳冷凍魚肉樣品的PCR產物直接測序和克隆測序結果經Chromas軟件驗證，圖譜一致，且為有效序列。經比對分析，從PCR全長序列中去除兩端引物的堿基，所得有效序列為658bp。

2.3 與GenBank中的序列比對

冷凍龍利魚柳的PCR產物所測定序列與GenBank中核酸序列進行BLAST比對，結果與編號gb|JN021313.1公布的654bp的Pangasianodon hypophthalmus線粒體CO I序列相似性為99.8%，其中僅有1個堿基差異。詳細信息如圖2所示。

2.4 與BOLD數據庫中的序列比對分析

將PCR擴增并測序得到的CO Ⅰ有效序列提交BOLD （Barcoding life）DNA條形碼數據庫分析，鑒定結果取相似度最高的前8位，見表1。

該冷凍魚肉樣品為口岸截獲，進口商在入境申報時申報該冷凍魚肉樣品為龍利魚柳，被截獲后改稱巴沙魚。本實驗室取樣進行CO Ⅰ PCR擴增，測序結果分別經GenBank Blast比對及BOLD DNA條形碼數據庫分析，鑒定名稱為Pangasianodon hypophthalmus，學名蘇氏圓腹魚芒，屬魚芒鯰科（Pangasiidae），分類學上在屬一級小有爭議，中文名多稱為巴丁魚。目前國內水產品市場多存在混淆名稱的“潛規則”現象。以本批次樣品為例，國內賣家近年來通稱越南巴沙魚為龍利魚，而包括多家水產門戶網站也都將巴丁魚歸為巴沙魚家族的一員。其實3者是不同的魚種，巴丁魚和巴沙魚的區別非常小，主要是魚的口舌位、魚胸鰭條目數等略有差別，而龍利魚則親緣關系較遠，更為稀有和昂貴。

2.5 水產品檢測結果匯總及分析

本批次監督抽檢共分析了16份進出口企業抽檢及口岸截獲魚肉、魚丸、蝦餃等水產制品，經DNA條形碼技術分析鑒定，除一份魚丸樣品未能鑒定出水產種類之外，其余15份樣品均成功擴增CO Ⅰ基因片段，并通過GenBank和BOLD 數據庫比對分析鑒定出了水產種類，鑒定結果匯總見表2。

其中，未能成功PCR擴增的8號白魚丸樣品經嘗試CO Ⅱ、CO Ⅲ及ITS等多個候選標靶基因均未能檢測到魚肉成分，ITS擴增鑒定存在大豆基因成分，除證實該樣品基因組DNA提取成功外，也暗示了其本身存在不含魚肉成分的可能。從嚴格意義上講，16份樣品中僅有2份的鑒定結果與標簽完全符合，占25.5%；約有31.25%的樣品鑒定結果與標簽標示不符。另有56.25%的樣品由于其標簽本身未能標示所含水產種類，而僅以魚或蝦的大類表示，根據檢測結果盡管不能判定其不合格，但也提示了產品標簽制度有需要進一步完善的地方。

需要說明的是，國際統一的生物物種命名應用的是拉丁文名稱，DNA條形碼的鑒定結果給出的以拉丁文名為準。而國內常用的學名及俗名則常常是五花八門，這也在客觀上為一些不法商家摻假、造假提供了可乘之機。

3 討 論

動物性食源物種種類繁多，非專業人士很難鑒別，且消費者在購買新鮮肉類、鮮活或冷凍水產品時，多是通過形態特征來判斷肉或魚的種類，但對于一些肉或魚肉制品（如肉餅、肉丸、魚片、魚丸等），則很難通過形態特征來判斷其原料的來源。食品行業一些不法商家正是利用此漏洞，為了追求最高商業利潤，便在加工食品中摻假造假，以低價食源冒充高價食品出售，一方面大大損害了消費者的利益和健康，另一方面也造成了不正當的商業競爭。其實，在此次“馬肉風波”事件之前，國內已經爆出了應用化學藥物處理的“假魚翅”、以牛肉膏處理的豬肉或鴨肉冒充牛肉等事件，但當時輿論更多地導向了食品安全領域而非商業欺詐的造假本身。

DNA條形碼技術目前國際上比較公認的是以細胞色素C氧化亞基Ⅰ（CO Ⅰ）的基因作為鑒定物種的靶基因，現有的研究數據表明絕大多數物種的CO Ⅰ序列表現出低的種內遺傳差異及相對較高的種間差異[14-15]。該項技術能避免形態學分類的缺陷，對鑒定者的經驗和專業知識背景要求較低。相比較于特異PCR、熒光PCR等技術，DNA條形碼技術有著無可比擬的優勢，但是DNA條形碼鑒別技術需要有專門的數據庫作為支撐。由于動物性食源種類繁多，目前的DNA條形碼數據庫還遠遠不夠完善，應用國際共享的DNA條形碼數據庫進行序列分析比對仍存在一定的不確定因素。同時，對于部分種類尤其是多成分加工食品的鑒別還需要在輔助靶基因[16]的篩選，與特異PCR、熒光PCR、AFLP及芯片技術相結合等方面進一步探索。

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