鹽酸四環素緩釋微球對成骨細胞增殖作用的研究

張玨　鄧媛媛　曾富佳

【摘要】 目的：觀察鹽酸四環素緩釋微球對體外培養大鼠成骨細胞的增殖活性。方法：體外分離培養SD大鼠成骨細胞，通過形態學觀察，茜素紅鈣結節染色鑒定成骨細胞生物學特征；將鹽酸四環素緩釋微球與成骨細胞共培養，用細胞計數法和MTT法檢測成骨細胞的增殖情況。結果：鹽酸四環素緩釋微球能夠在實驗的9天內持續促進成骨細胞增殖。結論：鹽酸四環素緩釋微球能促進成骨細胞增殖。

【關鍵詞】 鹽酸四環素緩釋微球；成骨細胞；增殖

【中圖分類號】R962 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007—8517（2013）18—0019—02

四環素及其無抗生素作用的化學異構衍生物（CMTs）具有特殊的藥理活性：抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）、抑制骨吸收、恢復成骨細胞結構和功能等，這些性質在骨科具有潛在臨床應用價值。前期研究證實低濃度鹽酸四環素，可促進體外培養的人胚成骨細胞活性及增殖，增加和加強細胞合成Ⅰ型膠原、骨鈣素等促進骨生成的物質，提示鹽酸四環素有較強促成骨潛能。而利用緩釋系統控制鹽酸四環素在組織中持續穩定的緩慢釋放，更能滿足骨愈合再生生理學規律的要求。本實驗旨在通過對制備的鹽酸四環素緩釋微球用于成骨細胞增殖作用的研究，確定鹽酸四環素緩釋微球潛在的應用價值。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器3～7d齡健康SD大鼠10只，雌雄不限，體重20～30g（四川大學實驗動物中心提供）；鹽酸四環素緩釋微球；胎牛血清（FBS，美國Gibco）；DMEM培養基（美國Gibco）；Ⅰ型膠原酶（美國Sigma）；胰蛋白酶（美國Gibco）；二甲亞砜（DMSO，美國Sigma）；MTT（美國Sigma）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；離心機（德國eppendorf公司）；CO₂細胞培養箱（德國Thermo公司）；細胞超凈工作臺（德國Thermo）；連續光譜測讀儀（美國Bio-Rad）。

1.2 方法和結果

1.2.1 SD大鼠成骨細胞分離培養及鑒定在無菌條件下剪取10只3-7d齡SD大鼠顱頂骨，用無菌PBS沖洗，并除去骨膜骨縫間結締組織和血細胞，將顱頂骨剪成約1mm×1mm碎塊，加入0.25%胰蛋白酶10ml，37℃條件下消化振蕩10min，棄上清，加入1：1（V/V）0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶的混合酶10ml，37%消化振蕩20min，并重復消化1次，收集2次消化的消化液，以400G.min-1離心5min。棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養基，吹打均勻，進行細胞計數，然后按1×10⁴·cm^-2個細胞密度接種于細胞培養瓶中，置于37℃、5%C02細胞培養箱中。3d后首次換液，以后間隔2天換液。待細胞長滿至80%～90%融合后，消化并按1：2比例傳代，倒置相差顯微鏡下觀察成骨細胞的生長情況和形態（圖1），可見成骨細胞貼壁生長，呈長梭形、三角形或多角形。取第2代細胞按1×10⁴·cm^-2密度分別接種于有血蓋片的6孔培養板中，培養21d，取出血蓋片，PBS清洗，行茜素紅鈣結節染色鑒定（圖2），其結果顯示成骨細胞培養21d后有明顯的紅色鈣結節生成。收集第3代細胞進行實驗。

1.2.2 實驗分組實驗分為二組，A組：空白對照組（含10%FBS的DMEM培養液）；B組：鹽酸四環素緩釋微球組（含10%FBS和四環素緩釋微球的DMEM培養液）。

1.2.3 鹽酸四環素緩釋微球對成骨細胞生長曲線的影響取生長良好的第3代成骨細胞，制成細胞懸液，鏡下計數后，以3×103個細胞/孔接種子24孔板上。用含10%FBS的DMEM培養基進行培養。置于37℃、5%C0₂細胞培養箱中培養24小時后，棄去培養液，分別加入實驗分組要求的培養液，于培養1d、2d、3d、5d、7d、9d后，每日每組

2 討論

四環素的抗菌特性性質用于局部組織中有促進成骨細胞分化和增殖的作用，并有誘導異位成骨的能力。在用復合鹽酸四環素的生物衍生骨修復兔橈骨缺損的研究中發現，其血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平，修復區成骨細胞和膠原纖維的生成均高于沒有復合四環素的對照組，而且骨愈合也早于對照組，說明四環素在骨組織再生過程中可能起到重要作用。四環素對成骨細胞的生物學效應研究顯示：低濃度四環素可增強成骨細胞的活力，細胞增殖明顯加快，細胞的群體倍增時間縮短。四環素促進骨愈合的機制，可能源于初始階段的抗菌作用；也可能通過抑制膠原酶的活性使骨的形態正常，或通過降低破骨細胞的活性抑制骨吸收，增強成骨細胞的活性刺激膠原的產生，從而促進骨再生。為了避免四環素的突釋現象，滿足骨愈合再生生理學規律的要求，持續促進骨生長的作用，將鹽酸四環素制備成緩釋微球可以滿足促進骨生長的要求。經研究，鹽酸四環素緩釋微球能夠促進成骨細胞持續增殖比鹽酸四環素多5～6天，同時，鹽酸四環素緩釋微球能顯著增加成骨細胞堿性磷酸酶的活性和Ⅰ型膠原的表達。本實驗單從細胞增殖的角度研究鹽酸四環素緩釋微球對成骨細胞的增殖活性，從結果可以看到，鹽酸四環素緩釋微球對體外培養成骨細胞具有增殖作用，在骨創傷治療中具有潛在的應用價值。