血管緊張素II對骨髓間充質干細胞定向誘導為角質形成細胞調控作用的實驗研究

徐媛　劉宏偉　程飚等

[摘要]目的：探討骨髓間充質干細胞（MSCs）分化為角質形成細胞的可能性及在此過程中血管緊張素II（AngII）對其的調控作用。方法：抽取Wistar大鼠的骨髓，經全骨髓法分離、純化MSCs，鑒定后建立MSCs細胞模型，用成膠質細胞誘導培養基誘導其為角質形成細胞，顯微鏡下觀察其形態學變化。以添加了AngII的成角質形成細胞誘導培養基組與單純成角質形成細胞誘導培養基組在誘導MSCs 7天、10天后行角蛋白10（CKP10） 免疫組織化學染色及流式細胞儀檢測，并進行對比觀察分析。結果：培養的MSCs具有成脂、成骨分化的能力。MSCs可以成功誘導為角質形成細胞，添加AngII的誘導組與對照誘導組CKP10免疫組化染色均有陽性表達，但添加AngII組陽性細胞數高于對照組。流式細胞儀檢測顯示CKP10陽性細胞百分率，AngII組為80.62%，對照組（32.46%），兩者相差顯著（P<0.05）。結論：MSCs可以誘導分化為角質形成細胞，ANGII對MSC的成角質形成細胞分化有顯著的促進作用，這一作用可能是AngII促進創面愈合的機制之一。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；角質形成細胞；創面愈合

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）07-0739-04

眾所周知，干細胞在創面修復中起到了重要的作用，其為創面愈合提供了各種組織細胞。業已證明，成體骨髓來源的間充質干細胞（MSCs） 具有多向分化潛能，可作為組織工程中多種種子細胞。關于MSCs分化為多種組織細胞的在體或離體實驗研究，國內外已多見報道[1-6]。但MSCs體外培養分化為上皮細胞相關報道較少，其過程中各種調控因素尚不清楚。許多實驗以及臨床現象已經證明，腎素-血管緊張素系統（RAS）對促進創面愈合起了積極重要的作用。為了探討MSCs是否能體外誘導分化為上皮細胞以及在這一過程中RAS所起的調控作用，筆者以Wistar大鼠為實驗對象，體外培養其MSCs，觀察 MSCs是否可分化為上皮細胞以及在這一過程中血管緊張素II（ANGII）所起到的調控作用。

1 材料和方法

1.1 MSCs的體外培養與鑒定：采用10～12周雄性Wistar大鼠（中山大學實驗動物中心提供），大鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下分離雙下肢，低糖DMEM培養液從雙側脛骨及腓骨沖出骨髓，50目網篩慮過骨渣，離心棄上清液，以含體積分數10%的胎牛血清青霉素（100U/ml）和鏈霉素（100μg/ml）的DMEM/ F12培養液重懸沉淀，1×109/L密度接種，于37℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養箱中培養。24h首次半量換液，以后每3 天全量換液一次。按1∶3傳代培養，接近融合的MSCs用質量濃度0.25%的胰蛋白酶（美國 Sigma公司）室溫消化30s～1min。取第3代MSCs進行實驗。取生長良好的第3代BMSCs，以2×104/ml的細胞密度接種于孔板中，分別加入成骨分化及脂向分化誘導液，觀察誘導情況。用ALP染色及油紅0染色鑒定MSCs多向分化能力。同時用流式細胞儀檢測MSCs的CD29、CD45、CD71、CD90的陽性率。

1.2 成上皮誘導：取第3代MSCs按上訴濃度接種于孔板中，用成上皮誘導液進行培養，每3天全量換液一次。成上皮誘導液配置為含體積分數10%的胎牛血清青霉素（100U/ml） 和鏈霉素（100μg/ml）的DMEM/F12培養液中加入0.5nM骨形成蛋白-4（BMP-4） （R&D Systems），0.3mM抗壞血酸，3 ng/ml人表皮生長因子。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態的變化。

1.3 ANG II調控成上皮誘導：取第3代MSCs按上訴濃度接種于孔板中，分別設置對照組與實驗組，對照組按上述成上皮誘導方案進行誘導，實驗組在原有成上皮誘導液內加入1×10-7mol/L的ANG II。兩組細胞均培養于37℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養箱中，每3天全量換各自誘導液一次。

1.4 免疫細胞化學染色：分別在對照組與實驗組細胞誘導7天及10天后，PBS洗去培養基，5%多聚甲醛固定，嚴格按照Maxim生物技術有限公司提供的免疫組化染色試劑盒說明書操作。氨基聯苯胺（DAB）顯色。角蛋白10（CKP10）多克隆抗體（Maxim）工作濃度1：100。蘇木精復染.以非特異血清代替抗作為陰性對照。角蛋白陽性細胞胞漿呈棕黃色。

1.5 流式細胞儀檢測：分別在對照組與實驗組細胞誘導3天及7天后，PBS洗去培養基，0.25%的胰蛋白酶消化后收集細。CKP10多克隆抗體（Maxim）工作濃度l：20，4℃孵育30min。PBS洗滌3次，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗鼠二抗（Sigma）工作濃度l：200，4℃孵育30min。PBS洗滌3次后，流式細胞儀（BectonDickinson）檢測。

2 結果

2.1 MSCs體外培養與鑒定：原代MSCs經24h體外培養，見少量貼壁細胞。貼壁細胞前2～3天生長緩慢，以后迅速增殖，呈克隆樣生長，細胞呈較均一的梭形，7～10天匯合，細胞呈比較均一的梭形（圖1）。BMSCs 經骨向誘導后第6天呈三角形或多角形。第8天，細胞外基質分泌增多，胞漿中及胞質外可見較多黑色顆粒，胞核色淡，胞漿色深。第21天，細胞聚集成多個散在結節，中心呈黑色致密團塊狀。鈣鈷法染色檢測 ALP 活性呈陽性，胞漿內見深黑色顆粒（圖2）。MSCs 經成脂誘導后第5天可見胞漿內黃色折旋旋光性小脂滴。隨時間推移，小脂滴增多融合成大脂滴，細胞核被脂滴擠于一側。10天油紅0染色示脂滴呈紅色（圖3）。同時，第3代 BMSCs表面CD29、CD90檢測陽性，CD45、CD71檢測陰性（圖4）。

2.2 MSCs誘導為上皮細胞已經ANGII在其中的調控作用：BMSCs經成上皮誘導后3天開始，部分細胞梭形形態發生變態，圍繞細胞核成圓餅形，細胞質減少，細胞核所占細胞整體比例明顯增大，細胞核有突起，呈典型上皮樣細胞形態。誘導后7天時，兩組細胞角蛋白10（CKP10）染色均成陽性，但實驗組陽性細胞數明顯多于對照組。誘導后10天CKP10染色，該現象更為明顯（圖5）。流式細胞儀檢測，同等誘導時間下，實驗組MSCs誘導為上皮細胞誘導率明顯高于對照組（圖6）。

3 討論

創傷后，機體除調動創傷局部組織的細胞直接參與修復以恢復受損組織的完整性外，還通過動員骨髓來源的干細胞向受損組織遷移，其在創面分化為創傷修復所需細胞來促進創面愈合。MSCs來源于中胚層，具跨胚層分化潛能，Friedenstein等（1974）把骨髓來源的成纖維細胞移植到腎包膜下，可以誘導形成骨和骨髓；體內外許多實驗表明MSCs有很大的可塑性，當把MSCs移植到非放射損傷宿主，MSCs可以分化為非造血組織細胞，包括肌肉、軟 骨、骨、肝、心臟、腦、腸及肺等[7-9]。胚胎發育中存在一系列上皮-間充質轉換，原始間充質細胞始于內細胞團，是首次上皮-間充質轉換，形成新的組織器官需從間充質向上皮轉換，反之亦然。關于MSCs誘導轉化為上皮細胞的研究，國內外文獻較少報道。木有已有的研究表明，支持MSCs能在特定條件下跨胚層誘導為上皮細胞，但誘導方案五花八門，誘導效能也各有高低[10]。在本試驗中，筆者將BMP-4、抗壞血酸以及人表皮生長因子加入常規培養基中，成功將MSCs誘導為上皮細胞，誘導成功率高。這一現象，提示在創面愈合過程中，MSCs有可能可以向上皮細胞轉化，為創面修復提供修復細胞，從而促進創面愈合。

雖然現有研究均指向MSCs能誘導分化為上皮細胞，但這一過程的調控因素及機制尚不明確。而由于MSCs的易獲得性、多能性以及低免疫原性，奠定了其作為再生醫學研究的重要靶細胞，并使人們看到了其臨床應用的實際可能。因此，闡明MSCs向上皮細胞分化中的調控因素對于再生醫學的臨床轉化有著重要的意義。

腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）是調節機體功能的重要激素系統之一。它不僅在調節血壓以及水電解質平衡方面起到重要作用，而且還在心、腦、肺和血管等組織器官的損傷修復中扮演重要的角色。最近的研究發現：RAS在皮膚損傷修復與再生過程中也起到非常重要的作用[11-12]，本實驗亦證明了RAS在MSCs中的存在。而ANGII作為RAS中的重要活性物質，是否對MSCs誘導為上皮細胞這一過程進行干預，引起了筆者的關注。由本實驗結果可以看出，添加ANGII組的上皮細胞轉化率明顯高于對照組，提高了誘導成功的可能性。一方面，機體內MSCs數量有限，若想獲得足夠數量的移植細胞，需經歷較長的體外擴增階段。如果在擴增階段對MSCs給予相當的誘導，能在一定程度上消除細胞分化時的不穩定性，指引其像上皮細胞分化。另一方面，在提供創面床ANGII含量，有助于已經移行至創面的MSCs高效的分化為上皮細胞，積極的參與到創面修復中來促進創面愈合。

MSCs向上皮細胞分化是一個復雜的生物學過程，可能涉及多種信號通路的調控。通過上述實驗結果，我們可以初步斷定，ANGII對MSCs向上皮細胞轉化有促進調節作用，而其調控實現機制有待于進一步的實驗來證明。相信隨著研究的進一步深入，MSCs轉化為上皮細胞從而促進創面愈合這一過程將清晰的展示在我們面前，并將為火熱的轉化醫學事業添磚加瓦。

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[收稿日期]2013-01-11 [修回日期]2013-03-22

編輯/張惠娟