子宮腺肌病中HIF—1α與MMP—2的表達及臨床意義

張繼紅　余繁榮　張蓉

[摘要] 目的 研究缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）與金屬蛋白酶-2（MMP-2）在子宮腺肌病（AM）中的表達情況，探討其在AM發生發展中的作用。 方法 應用免疫組化（SABC）檢測90例AM標本，36例卵巢子宮內膜異位囊腫及30例正常子宮內膜中的HIF-1α及MMP-2的表達。 結果 HIF-1α在AM的異位內膜及在位內膜組織中的表達75.0%和42.9%，差異有統計學意義（P < 0.01）。HIF-1α與MMP-2在AM組織中表達與正常子宮內膜比較，差異有統計學意義（P < 0.05），HIF-1α與MMP-2在卵巢子宮內膜異位囊腫及正常子宮內膜中表達（P﹤0.05），HIF-1α及MMP-2在AM組織與卵巢子宮內膜異位囊腫陽性表達差異無統計學意義（P > 0.05）。HIF-1α及MMP-2在AM的表達呈正相關（r = 0.341，P = 0.001）。 結論 HIF-1α及MMP-2可能促進子宮內膜在子宮肌層的種植生長起協同作用。

[關鍵詞] 子宮腺肌病；免疫組織化學；HIF-1α；MMP-2

[中圖分類號] R473.71 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）06-0063-03

子宮腺肌病（adenomyosis，AM）是指子宮內膜的腺體和間質侵入子宮肌層，病灶在肌層內呈良性浸潤及彌漫性生長，并伴隨周圍肌層細胞的代償性肥大和增生。AM為婦科常見的疾病之一，近年來有逐漸升高的趨勢，好發于30～45歲，主要表現為繼發性進行性加重的痛經、月經增多、不孕不育及子宮增大，不同程度影響著育齡婦女的身心健康和生活質量。其病因和發病機制仍不清楚。Romanek K[1]研究表明多次妊娠、習慣性流產和多次宮內操作史均為本病的危險因素，子宮基底層的損傷明顯增加AM的發病率。有實驗表明在子宮內膜向肌層浸潤轉移的過程中血管的形成與基底膜屏障的破壞是重要環節。缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）及金屬蛋白酶-2（matrix metallo proteinase-2，MMP-2）在促進血管的形成、細胞突破子宮內膜-肌層界面（endmetrial-myometrial interface，EMI）及侵襲轉移中起重要作用。本研究旨在通過檢測HIF-1α及 MMP-2在子宮腺肌病異位及在位內膜組織中的表達，探討子宮腺肌病的發病機制及其二者的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

取2010年9月～2012年6月我院病理科存檔的石蠟標本：手術切除經病理證實為子宮腺肌病且不合并子宮內膜其他病變的標本90例，其中異位內膜48例，在位內膜42例。卵巢子宮內膜異位囊腫組織36例，因子宮肌瘤行手術切除的標本為正常子宮內膜標本30例，患者年齡為26～50歲，平均（40.6±3.2）歲。所有患者術前3個月內均無性激素類藥物治療，無內分泌、免疫、代謝性疾病及其他藥物治療史。

1.2 試劑

鼠抗人單克隆抗體缺氧誘導因子1α（HIF-1α）（產品編號：MAB-0635）購自北京中杉金橋公司；鼠抗人單克隆抗體基質金屬蛋白酶（MMP-2）（產品編號：MAB-0244）；免疫組化試劑盒，DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 方法

采用免疫組化染色（SABC）：標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm 厚連續切片，實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 結果判定標準

光學顯微鏡下染色強度按下列標準評分：著色弱但明顯強于陰性對照者1分，染色清晰者2分，染色強者3分；陽性細胞占總細胞數的10%～50%者2分，51%～80%者3分，>80%者4分。上述兩項評分相加，不管其染色強度，只要陽性細胞數<10%者即為（-）；3分為弱陽性（+）；4～5分為陽性（++）；6～7分為強陽性（+++）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件包進行分析，HIF-1α及MMP-2在子宮腺肌病中的表達研究采用χ2檢驗，二者的相關性應用Spearman等級相關分析，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α在子宮腺肌病、子宮內膜異位囊腫及正常子宮內膜組織中的表達

在子宮腺肌病組織HIF-1α蛋白陽性表達為棕黃色或棕褐色顆粒，主要表達于子宮內膜細胞及腺上皮細胞的胞質和胞核， 以胞漿為主。HIF-1α在子宮腺肌病及卵巢子宮內膜異位囊腫組織中的陽性表分別為60.0%和66.7%，差異無統計學意義（χ2=0.485，P = 0.486）；其在正常子宮內膜組織中的陽性率26.7%，與子宮腺肌病及卵巢子宮內膜異位囊腫的陽性表達比較均有統計學意義（P < 0.05）；HIF-1α在子宮腺肌病的異位內膜及在位內膜組織中的表達的陽性表達率分別為 75.0%和42.9%，差異有統計學意義（P < 0.01），見表1。

2.2 MMP-2在子宮腺肌病、子宮內膜異位囊腫及正常子宮內膜組織中的表達

MMP-2主要定位于子宮內膜細胞的胞漿內及腺上皮細胞，呈棕黃色。MMP-2在子宮腺肌病組織中的陽性表達64.4%，明顯高于正常子宮內膜組織的陽性表達33.3%，差異有統計學意義（P < 0.01）；而在子宮內膜異位囊腫的陽性表達58.3%，子宮腺肌病與卵巢子宮內膜異位囊腫組織比較，差異無統計學意義（χ2=0.411，P = 0.522）；正常子宮內膜組織與卵巢子宮內膜異位囊腫的陽性表達差異有統計學意義（P < 0.05）；MMP-2在子宮腺肌病的異位內膜及在位內膜組織中的陽性表達率分別為79.2%和47.6%，差異有統計學意義（P < 0.01），見表2。

2.3 HIF-1α 及MMP-2在子宮腺肌病組織中表達的相關性

HIF-1α 及MMP-2在子宮腺肌病的表達呈正相關（r =0.341，P = 0.001），見表3。

3討論

3.1 HIF-1α與子宮腺肌病的關系

HIF-1α是缺氧環境下大量表達的一種轉錄因子，在常氧下極不穩定，可被泛素-蛋白酶迅速降解，而缺氧狀態則抑制其降解，HIF-1α與下游靶基因啟動子區域的缺氧反應元件（hypoxia responsive element，HRE）結合，調控其轉錄[2]。目前已確定的HIF-1α靶基因大部分參與了轉移級聯反應過程， 包括上皮細胞間質轉型（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、細胞外基質和基底膜降解、腫瘤細胞運動能力增加、新生血管形成等[3]。H■pfl[4]在實驗中證實HIF-1α可誘導促血管生成因子如VEGF的表達，促進新生血管形成，為腫瘤細胞的侵襲和轉移創造條件。血管的生成是子宮內膜侵入肌層生長發育的必備條件，不僅為異位內膜生長提供營養，還有可能是內膜細胞從正常在位組織轉移至子宮平滑肌的重要途徑[5]。

本實驗表明，在HIF-1α在子宮腺肌病組織中的陽性表達率（60.0%）明顯高于正常內膜組（26.7%），差異有高度統計學意義（P < 0.01）。HIF-1α在子宮腺肌病的異位內膜及在位內膜組織中陽性表達率分別為75.0%和42.9%，差異有統計學意義，與任月芳[6]研究結果相符。表明子宮腺肌病病灶在浸潤過程中HIF-1α大量表達，進一步促進子宮內膜VEGF大量分泌，VEGF水平的升高可促進異位內膜及其周圍肌層血管的形成，加速異位內膜的種植和增殖，提示HIF-1α的高表達可能與AM的發病密切相關。

3.2 MMP-2與子宮腺肌病的關系

基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）是MMPs家族的重要成員之一，定位于人類染色體16q21，是一種依賴鋅離子而降解細胞外基質的蛋白水解酶類之一，其主要功能是降解細胞外基質的各種膠原纖維，研究表明MMPs/TIMPs與組織侵襲有關，其失衡可引起細胞外基質（ECM）的降解和重建，與EMT及AM的發生、發展密切相關[7]。

本實驗結果顯示子宮腺肌病異位內膜組中MMP-2的陽性表達率79.2%，顯著高于在位內膜（47.6%）及正常子宮內膜組（33.3%），差異有統計學意義。與Matsuda等[8]的研究一致，其通過子宮腺肌病及正常子宮內膜中MMP-2的表達情況及酶活性的研究，也證實了子宮腺肌病中MMP-2活性及MMP-2 mRNA的水平較對照組有升高的趨勢。Moreira等[9]研究發現MMP-2在AM重度組的子宮內膜、內膜-肌層邊界、肌層和肌層血管的表達明顯高于輕度組。王浩等[10]進一步實驗得出AM組EMI處的內膜腺體中MMP-2的高表達和TIMP-2的低表達，使子宮內膜的侵蝕能力增強，說明MMP-2的過度表達使得子宮腺肌病異位病灶組織能降解其周圍基底膜及細胞外基質成分， 破壞間質細胞之間連接，使細胞侵襲能力增強，從而使阻止子宮內膜侵入的“天然屏障”遭到破壞，突破基底膜，侵入肌層，為子宮腺肌病的形成提供了條件。

3.3 HIF-1α及 MMP-2之間關系

本研究顯示在子宮腺肌病組織中HIF-1α及 MMP-2的表達成正相關（r = 0.341，P = 0.001）。研究表明缺氧環境中，HIF-1α誘導激活蛋白水解物（包括尿激酶型纖維蛋白酶原激活物，組織蛋白酶D和MMP-2[6]，在病灶處HIF-1α激活VEGF基因的轉錄，促進新生血管的形成，MMP-2降解EMI成分，二者協同作用使子宮內膜細胞向肌層侵襲、轉移從而使子宮內膜異位到肌層，因此對HIF-1α及MMP-2的研究為子宮腺肌病的診治提供了新的思路。

[參考文獻]

[1] Romanek K，Bartuzi A，Boqusiewicz M，et al. Risk factors for adenomyosis in patients with symptomatic uterine leiomyomas[J]. GinekolPol，2010，81（9）：678-680.

[2] Majmundar AJ，Wong WJ，Simon MC. Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress[J]. Mol Cell，2010，40（2）：294-309.

[3] DeClerck K，Elble RC. The role of hypoxia and acidosis in promoting metastasis and resistance to chemotherapy[J]. Front Biosci，2010，15：213-225.

[4] H■pfl G，Ogunshola O，Gassmann M. HIFs and tumor-causes and consequences[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，286（4）：608-623.

[5] Kang S，Zhao J，Liu Q，et al. Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms are associated with the risk of developing adenomyosis[J].Environ Mol Mutagen，2009，50（5）：361-366.

[6] 任月芳. 自噬相關基因Beclin1在子宮腺肌病中的作用及缺氧對Beclin1影響的研究[D]. 浙江大學醫學院，2010.

[7] Collette T，Maheux R，Mailloux J，et al. Increased expression of matrix metalloproteinase-9 in the eutopic endometrial tissue of women with endometfiosis[J]. Hum Reprod，2006，21（12）：3059-3067.

[8] Matsuda M，Sasabe H，Adachi Y，et al. Increased invasion activity of endometrial stromal cells and elevated expression of matrix metalloproteinase messenger RNA in the uterine tissue of mice with experimentally induced adenomyosis[J]. Am J Obstet Gynecol，2001，185（6）：1374～1380.

[9] Moreira L，Carvalho EC，Caldas-Bussiere MC. Differential immunohistochemical expression of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in cow uteri with adenomyosis during follicular phase[J]. Veterinary Research Communications，2011，35（5）：261-269.

[10] 王浩，魏華芳，謝守珍. 基質金屬蛋白酶-2及其抑制劑在子宮腺肌病子宮內膜-肌層界面中的表達[J]. 武漢大學學報（醫學版），2010，31（4）：468-470.

（收稿日期：2013-01-04）