十大技術(shù)之一（一）西瓜資源與品種核酸指紋鑒定關(guān)鍵技術(shù)

張海英 許勇

當(dāng)前西瓜生產(chǎn)中種子質(zhì)量問題比較突出和普遍，種子純度不夠和假種子坑農(nóng)事件常有發(fā)生，常規(guī)的品種審定/鑒定主要以形態(tài)學(xué)特征為依據(jù)，鑒定周期較長，長達(dá)3—4個月，因此，急需建立早期、快速、準(zhǔn)確的西瓜種子純度和品種真實性檢測技術(shù)。

1 技術(shù)概述

在西瓜全基因組測序與重測序的研究基礎(chǔ)上，研發(fā)了一套最大限度準(zhǔn)確反映西瓜品種資源多樣性與遺傳親緣關(guān)系23對SSR核心引物序列，并利用核心引物建立1 300多個西瓜種質(zhì)資源的核酸指紋庫（圖1、表1）。圖1、表1顯示分析結(jié)果基本一致。

2 技術(shù)要點

1）DNA提取：取植株下胚軸或幼葉30～40 mg，CTAB法或堿法快速提取DNA。

2）PCR擴(kuò)增體系：每種dNTP 0.25 mmol·L-1， 正向引物0.2 μmol·L-1，反向引物0.2 μmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，10×PCR緩沖液（含Mg2+），樣品DNA 60 ng，其余以超純水補足。推薦使用15或20 μL反應(yīng)體積。

3）PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸15 s，循環(huán)34次；最后72 ℃ 延伸4 min。10 ℃ 保溫待用。

4）PCR產(chǎn)物檢測：8% 聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分離，采用快速銀染法顯色。

3 技術(shù)實施效果

3.1 西瓜品種純度和真實性分析

利用SSR核心引物組合，可有效區(qū)分95%以上的供試育種材料，特別是對于來源于共同祖先的親緣關(guān)系極近的材料，其外觀表型性狀極其相近，采用常規(guī)田間種植觀察較難準(zhǔn)確區(qū)分，如京欣類型材料97103和98R，二者果實外觀、植株形態(tài)等極似，但引物BVWS00106可以有效區(qū)分二者（圖2）。目前，采用SSR核心引物組合，已對本中心育成的京欣2號、京闌、京玲、華欣等西瓜新品種進(jìn)行了純度鑒定，分子鑒定和田間鑒定吻合率達(dá)95%以上（圖3）。

3.2 西瓜育種材料遺傳背景分析

利用篩選得到的SSR核心引物組合對 17份重測序材料和100份西瓜育種材料進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果與供試材料系譜相對照，基本反映出了供試材料種質(zhì)資源親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。該分類結(jié)果從DNA水平上體現(xiàn)了這些種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，可以為西瓜育種親本選擇提供理論依據(jù)（圖4）。