復合反膠束萃取花生蛋白的工藝優(yōu)化

郭 珍 陳復生 方志鋒

GUO Zhen CHEN Fu-sheng FANG Zhi-feng

（河南工業(yè)大學，河南 鄭州 450001）

(Henan University of Technology,Zhengzhou,Henan 450001,China)

花生中富含脂肪和蛋白質，既是主要的食用植物油來源，又可提供豐富的植物蛋白質。其中花生蛋白含量在22%～26%，花生中蛋白質的營養(yǎng)價值與動物蛋白質差異不大，比牛奶、豬肉、雞蛋的蛋白質含量都高，而且膽固醇含量低，其營養(yǎng)價值在植物性蛋白中僅次于大豆蛋白[1]。由于花生中脂肪含量高達45%，在生產花生蛋白時必須先將油脂分離出去，而傳統(tǒng)的制油方法均采用壓榨或預榨—浸出的方法，過程中由于受到溫度的作用均難保證蛋白質的質量，因此，尋求一種新型分離花生蛋白技術具有很重要的現實意義。

反膠束萃取技術是20世紀70年代提出的一種分離技術。反膠束是將表面活性劑溶于非極性溶劑中，通過偶極—偶極或離子對之間的相互作用形成的一種各向同性、光學上透明并且熱力學上穩(wěn)定的聚集體。在反膠束溶液中，表面活性劑非極性頭朝外與溶劑接觸，極性頭朝內增溶一部分水形成“水池”，蛋白質等生物分子通過與“水池”之間相互作用實現萃取[2]。由于能形成反膠束的單一表面活性劑并不多或性質上有一定的局限性，且研究[3，4]發(fā)現，把不同類型表面活性劑混合起來制備可以形成具有良好性質的混合反膠束體系，增加增溶水量。因此，本試驗試圖選擇AOT/SDS復合反膠束進行花生蛋白萃取，并通過正交優(yōu)化選擇最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

全脂花生粉：河南帝鑫食品有限公司；

丁二酸二異辛酯磺酸鈉(AOT)：上海海曲化工廠；

十二烷基硫酸鈉(SDS)：天津市科密歐化學試劑有限公司；

卡爾費休液：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；

異辛烷、正辛醇：分析純，天津市博迪化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：BS210S型，德國Sartorius公司；

高速冷凍離心機：GL-20L型，上海安亭科學儀器有限公司；

自動水分滴定儀：ZSD-2J型，上海安亭電子儀器廠；

酸度計：pH 211型，意大利Hanna公司；

移液槍：Nichipet EXII型，日本Nichiryo公司；

紫外分光光度計：UV-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司；

超聲波清洗器：KQ-250B型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質標準曲線制作 根據文獻[5]。

1.2.2 原料蛋白含量測定 按GB/T 50095——2010第二法執(zhí)行。

1.2.3 反膠束溶液中WO測定 根據文獻[6]。

1.2.4 AOT/SDS復合反膠束配制 按一定的質量比稱取AOT，SDS置于100mL錐形瓶，同時加入有機溶劑異辛烷，正辛醇，使其溶解，加入一定量一定濃度KCl的KH2PO4—Na2HPO4緩沖溶液，超聲振蕩至溶液透明。

1.2.5 花生蛋白的萃取 將配制的AOT/SDS反膠束溶液置于100mL錐形瓶中，加入一定量花生粉，超聲處理一段時間，以5 000 r/min的轉速離心5min，取上清液，用紫外分光光度計在280 nm處測定其吸光值(反膠束溶液作為空白液)。

1.2.6 花生蛋白提取條件的優(yōu)化 以測定蛋白質前萃率為指標，分別考慮超聲時間、花生濃度、超聲功率、pH、離子濃度、溫度、W0值、AOT(g)∶SDS(g)值以及表面活性劑濃度對萃取率的影響。基本條件：超聲時間20 min，花生濃度0.01 g/mL，超聲功率270W，pH值為7，離子濃度為0.01 mol/L，溫度35 ℃，W0值 12，AOT（g）∶SDS（g）為 4∶3，表面活性劑濃度0.07 g/mL。本試驗單因素設計中各因素變化值：超聲時間3，6，9，12，20，25，30，35，40 min；花生濃度 0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06g/mL； 超 聲 功 率 150，180，210，240，270，300 W；pH6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0；離子濃度 0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mol/L；溫度 25，30，35，40，45，50 ℃；W0值5，7，9，12，15；AOT(g)∶SDS(g)為 2∶3，3∶4，1∶1，4∶3，3∶2，2∶1；表面活性劑濃度 0.06，0.07，0.08，0.09，0.10，0.11 g/mL。在單因素試驗結果的基礎上，設計正交試驗優(yōu)化花生蛋白提取工藝。

1.2.7 蛋白質前萃率的計算 按式(1)進行。

式中：

R——花生蛋白前萃率，%；

m1——反膠束溶液中蛋白質的質量，g；

m2——原料中蛋白質的質量，g。

2 結果與分析

2.1 蛋白質定量分析標準曲線

蛋白質定量分析標準曲線見圖1。

圖1 蛋白質定量分析標準曲線Figure 1 Standard curve of protein quantitative analysis

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲時間對前萃率的影響 由圖2可知，萃取率隨時間的延長而增加，12min后基本達到最大，這是由于原料中蛋白不斷向“水池”中遷移，使?jié)舛炔顪p小，萃取效率降低最終達到平衡，與單一表面活性劑形成的反膠束體系相比，萃取速度明顯加快，這可能是由于降低了臨界膠束濃度形成了更多的“水池”。

圖2 超聲時間對花生蛋白前萃率的影響Figure 2 Impacton peanut protein extraction rate by ultrasonic time

2.2.2 花生濃度對前萃率的影響 由圖3可知，萃取率隨花生濃度的增加而降低，主要原因是花生濃度的增加使空間位阻增加，而反膠束的聚集數以及增溶水量是固定不變的，花生蛋白之間的相互競爭致使萃取率降低。

圖3 花生濃度對蛋白前萃率的影響Figure 3 Impact on peanut protein extraction rate by peanut concentration

2.2.3 超聲功率對前萃率的影響 由圖4可知，萃取率隨超聲功率的增加先增加后降低。超聲波的空化作用以及機械效應為反膠束萃取提供了一定的推動力，降低分子擴散阻力，加快溶劑以及蛋白分子擴散速度，增加蛋白分子進入“水池”的可能性，從而使萃取率增加。此外，與單一使用SDS表面活性劑形成的反膠束體系相比節(jié)約能耗[7]。

圖4 超聲功率對花生蛋白前萃率的影響Figure 4 Impact on peanut protein extraction rate by ultrasonic power

2.2.4 pH值對前萃率的影響 由圖5可知，萃取率隨pH值升高呈先增大后減小。據報道[8]，蛋白質與反膠束之間的靜電引力是萃取的主要推動力，而在試驗中，pH等于8時萃取率最高，此時，蛋白分子帶負電，與AOT、SDS帶同種電荷，因此，有可能存在離子交互作用以及蛋白質疏水作用等影響著萃取過程。

圖5 pH值對花生蛋白前萃率的影響Figure 5 Impact on peanut protein extraction rate by pH

2.2.5 離子濃度對前萃率的影響 由圖6可知，萃取率隨著離子濃度的增加先緩慢增加后快速下降。隨著鹽濃度增加時，表面活性劑周圍的電層厚度變薄，減小了表面活性劑極性頭之間的排斥作用，使反膠束變小，從而使蛋白質在反膠束中的增溶量減小，此外，鹽濃度的增大同時對反膠束產生脫水效應，萃取率降低[9]。

圖6 離子濃度對花生蛋白前萃率的影響Figure 6 Impact on peanut protein extraction rate by ionic concentration

2.2.6 溫度對前萃率的影響 由圖7可知，萃取率隨溫度的增加先升高后降低，在40℃時達到最大。溫度升高一方面會增加分子熱運動，使傳質速率增加從而增加萃取率，另一方面，溫度過高會破壞反膠束結構，同時使蛋白分子變性[10]。

圖7 溫度對花生蛋白前萃率的影響Figure 7 Impact on peanut protein extraction rate by temperature

2.2.7 W o對前萃率的影響 W o是反膠束的一個重要參數。反膠束物理性質主要取決于W o，W o決定了反膠束的大小和每個膠束中所含表面活性劑的個數。研究[11]發(fā)現，隨著W o的增加，反膠束直徑增加，且滿足以下關系式dwp=0.29W o+1.1(2

圖8 W o對花生蛋白前萃率的影響Figure 8 Impacton peanut protein extraction rate by W o

2.2.8 AOT(g)∶SDS(g)對前萃率的影響 由圖9可知，萃取率隨AOT(g)∶SDS(g)的升高呈先增大后減小。在比值為3∶2時達到最大，這有可能是因為混合表面活性劑改變了臨界膠束濃度，AOT與SDS非極性端存在的排斥作用影響著反膠束的大小，形狀以及增溶水的能力，有待進一步研究。

圖9 AOT(g)/SDS(g)對花生蛋白前萃率的影響Figure 9 Impact on peanut protein extraction rate by AOT(g)/SDS(g)

2.2.9 表面活性劑濃度對前萃率的影響 由圖10可知，隨著表面活性劑濃度的升高萃取率逐漸降低。試驗發(fā)現，在表面活性劑濃度小于0.06 g/mL時無法配成反膠束溶液。其原因可能是在濃度為0.06 g/mL時達到飽和狀態(tài)萃取率最高，繼續(xù)增加表面活性劑的量阻礙了蛋白質的萃取。

圖10 表面活性劑濃度對花生蛋白前萃率的影響Figure 10 Impacton peanut protein extraction rate by Surfactant concentration

2.3 正交設計及試驗結果

選取影響萃取的7個主要因素：溫度、KCl濃度、pH、反膠束濃度、AOT/SDS、超聲功率、WO，在花生濃度 0.01 g/mL，超聲時間15min條件下，以萃取率為指標進行七因素三水平正交優(yōu)化，確定萃取最佳工藝。因素水平表見表1，正交設計及結果見表2，方差分析見表3。由試驗結果分析可知，各因素對試驗結果影響的主次順序為G>D>B>C>E>A>F，超聲功率對試驗結果影響最小，可以歸為誤差項。由表3可知，WO對花生蛋白前萃率影響極其顯著，反膠束濃度以及KCL濃度對花生蛋白前萃率影響顯著，溫度、pH值、AOT與SDS比值對花生蛋白前萃率影響不顯著。由表2可知，A1B1C2D3E1F1G3為最優(yōu)方案，進行優(yōu)化實驗驗證(n=7)，在此條件下，萃取率為93.33%。即最佳萃取條件為溫度35℃，KCl濃度0 mol/L，pH 8，反膠束濃度 0.08 g/mL，AOT(g)∶SDS(g)為 4∶3，超聲功率180W，WO值為 15。

表1 因素水平表Table1 Factors and levels

表2 正交試驗設計及試驗結果Table2 Orthogonal testand results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

F0.05(2，2)=19，F0.01(2，2)=99。

差異源 自由度F 顯著性A B C D E G 1.570 21.551 7.624 45.366 7.200 577.658****誤差項(F)離差平方和18.064 247.950 87.720 521.955 82.838 6 646.186 11.505 41 2 2 2 2 2 2 2均方v9.032 123.975 43.860 260.977 41.419 3 323.093 5.752 706

3 結論

本試驗采用AOT、SDS與異辛烷正辛醇形成的復合反膠束對花生中蛋白質進行萃取，研究發(fā)現，不僅萃取率得到提高，且萃取時間大大縮短，形成反膠束的效率也有很大提升，與單一反膠束體系相比表現出了明顯的優(yōu)勢，通過單因素以及正交試驗設計確定了最佳工藝條件：溫度35℃，KCl濃度0mol/L，pH 8，反膠束濃度 0.08 g/mL，AOT(g)∶SDS(g)為 4∶3，超聲功率180W，W o值為15。但AOT、SDS在溶劑中是通過怎樣的連接方式形成反膠束，以及萃取過程中的相互作用力，萃取模型都尚未清楚，有待進一步研究。

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