ROL酶解制備富含甘油二酯的大豆油工藝的優化

張夢柯 石 波 李 穎 李 超 左劍南 程永強

ZHANGMeng-ke1 SHIBo2 LI Ying3 LIChao1 ZUO Jian-nan1 CHENG Yong-qiang1

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院植物源功能食品北京市重點實驗室，北京 100083；2.中國農業科學院飼料研究所，北京 100081；3.中國農業大學生物學院，北京 100083）

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing 100081,China;3.College of Biological Sciences,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

甘油二酯（diacylglycerol，DAG）是甘油三酯（triacylglycerol，TAG）中一個脂肪酸被羥基所取代的結構脂質,有1,2-DAG和1,3-DAG兩種同分異構體[1]。DAG是油脂的天然組成成分，但含量很低，通常不超過10%[2]。DAG與TAG具有相似的口感、色澤、風味、質地和能量值（DAG為38.9 kJ/g，TAG為39.6 kJ/g）[3,4]。研究表明，不飽和脂肪酸型的甘油二酯具有抑制脂肪在動物和人體內積累的功能[5-7]，這主要是因為DAG，尤其是1,3-DAG，在小腸內不能降解為 2-單甘酯（monoglyceride，MAG），這些生理差異使甘油二酯的餐后血脂降低，體內脂肪酸氧化速率加快[8]。甘油二酯的這些功能和特點使其作為一種安全健康的食用油[9]，在日本及美國的市場上深受廣大消費者的歡迎。

近年來，中國在甘油二酯的生產工藝上進行了一些研究，主要有化學合成法，生物酶合成法（包括油脂水解法、油脂醇解法、直接酯化法和油脂甘油解法）和微生物發酵法[10]，其中利用脂肪酶催化生產甘油二酯，具有反應條件溫和、生產得率高、產品品質高、環境污染小等優點,是最具應用前景的生產工藝。然而脂肪酶催化水解制備甘油二酯的文獻報道并不多，因此本試驗以大豆油為材料，對3種不同脂肪酶進行了系統的篩選，并進一步對其中最優的脂肪酶催化水解制備富含甘油二酯的工藝條件進行優化，旨在為實現甘油二酯的工業化生產提供一定的研究基礎和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

大豆油：福臨門大豆油，市售；

RML、ROL和ALIP脂肪酶：中國農業大學生物學院提供；

1，3-二亞油酸甘油酯標樣：美國Sigma公司

乙腈、異丙醇、甲酸：色譜純，美國Fisher公司；

1.2 主要試驗設備

分析天平：AR2140型，美國奧豪斯公司；

磁力攪拌器：RTC basic型，德國IKA公司；

示差折光檢測器：2944型，美國Waters公司；

高壓輸液泵：2695型，美國Waters公司；

恒溫培養振蕩器：ZHWY-200D型，上海智誠分析儀器制造有限公司；

色譜柱：Sunchrom ODSC18（4.6mm×250mm，5μm）型，北京金歐亞有限公司；

高速離心機：HC-2518型，科大創新股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理 稱取2.5 g大豆油于 50 mL的錐形瓶中，并將其置于恒溫培養箱中，預熱至設定溫度后，加入一定量的酶液和水，用恒溫培養振蕩器在一定的攪拌速度下，反應一定的時間。反應結束后，反應液沸水滅活10min，冷卻后離心10min，取上清液進行分析。

1.3.2 分析方法

(1)樣品前處理：從大豆油原料及上述反應產物中的上清液里取少量樣品，用流動相溶解樣品配制濃度為10mg/mL。取1.5mL過0.45μm有機膜于進樣瓶中。

(2)甘油二酯的組成測定：采用高效液相（HPLC）測定。檢測條件：乙腈—異丙醇（70/30，V/V）流動相等度洗脫；流動相流速為1.0 mL/min；檢測器溫度30℃；柱溫30℃；樣品進樣量20μL；示差檢測器檢測；面積歸一化法定量。因為大豆油酶解后產物中甘油二酯是混合物，成分比較復雜，其中還包括DAG的異構體，所以不可能通過商業渠道購買所有DAG的標準樣品用來確定產物中每一種DAG的含量[11]。大豆油中甘油三酯主要是 LLL，LLO，LLP，OLO 和 PLO[12]，理論上講，甘油二酯產物中二亞油酸甘油酯的含量應該相對較多，故本試驗用酶解產物中1，3-亞油酸甘油酯作為定量分析酶解產物中甘油二酯含量的一個指標。

(3)數據處理：每個條件做3次平行試驗，取平均值進行結果分析。

1.3.3 單因素試驗

(1)不同酶催化下反應時間對酶催化水解產生甘油二酯含量的影響：在溫度35℃、含水量28.57%、加酶量20 U/g、攪拌速度150 r/min的條件下，以酶解產物中1，3-二亞油酸甘油酯為衡量指標，考察不同脂肪酶催化下大豆油酶解反應情況。

(2)反應溫度對酶催化水解產生甘油二酯含量的影響：在時間4 h、含水量 28.57%、加酶量64 U/g、攪拌速度150 r/min的條件下，考察溫度對酶催化水解反應效率的影響。

(3)加酶量對酶催化水解產生甘油二酯含量的影響：在溫度30℃、時間4 h、含水量 70.59%、攪拌速度150 r/min的條件下，考察加酶量對酶催化水解反應效率的影響。

(4)含水量對酶催化水解產生甘油二酯含量的影響：在溫度30℃、時間4 h、加酶量64 U/g、攪拌速度150 r/min的條件下，考察含水量對酶催化水解反應效率的影響。

(5)攪拌方式及轉速對酶催化水解產生甘油二酯含量的影響：在溫度30℃、時間4 h、加酶量64 U/g、含水量28.57%的條件下，考察不同攪拌速度對酶催化大豆油水解效率的影響，同時對比了恒溫振蕩箱和磁力攪拌器兩種攪拌方式對反應效率的影響。

2 結果與討論

2.1 試驗用酶的篩選

采用脂肪酶（RML，ROL和ALIP），分別測定了在不同酶的催化下生成的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨催化時間的變化，其結果見圖1。

圖1 不同酶催化下反應時間對酶解反應效果的影響Figure 1 Influence of reaction time on enzymatic hydrolysis of different lipases

由圖1可知，ALIP催化大豆油產生甘油二酯的能力最低，其主要原因可能是該酶無1，3位催化特異性。RML和ROL雖然都是1，3位特異性催化酶，但ROL的催化活性更高，其產物中1，3-二亞油酸甘油酯含量高達16%以上，且經4 h反應就基本達到平衡，所以后續研究選用ROL為試驗用酶，反應4 h最佳。

2.2 反應溫度對酶催化水解產生甘油二酯含量的影響

以ROL為催化劑，測定了水解產生的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨反應溫度的變化，其結果見圖2。

由圖2可知，隨著反應溫度的升高，酶催化水解大豆油的反應效率在 25～45℃的溫度范圍內幾乎沒有太大變化。這說明ROL在一定范圍內對溫度的變化不敏感。在反應溫度上升到50℃之后，酶的催化效率隨著溫度的升高而迅速降低，到60℃時，酶的催化活性已經很低了。這是因為一定范圍內溫度的增加可以減少混合物的黏度，提高溶解度和改善底物的擴散過程，從而減少傳質的限制，有利于酶與底物之間的相互作用[13]；然而由于酶是具有生物活性的大分子物質，過高的溫度會使酶催化中心的空間構象發生了不可逆的變化，酶的催化活性降低甚至失活。從實際生產的角度考慮，反應溫度取30℃最為適宜。

圖2 溫度對酶解反應效果的影響Figure 2 Influence of reaction time on enzymatic hydrolysis

2.3 加酶量對酶催化水解產生甘油二酯含量的影響

以ROL為催化劑，測定了水解產生的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨加酶量的變化，其結果見圖3。

圖3 加酶量對酶解反應效果的影響Figure 3 Influence of enzyme load on enzymatic hydrolysis

由圖3可知，隨著酶量的增加，酶的催化效率逐漸提高，但當加酶量超過64 U/g時，反應產物中甘油二酯的含量幾乎不再變化。這主要是因為在一定的范圍內，酶濃度的增加使反應體系中的酶分子有更多的活性部位與底物接觸，反應效率提高；但是當酶活性部位過量時，將有可能由于蛋白的聚集作用而不再與底物接觸[14]，從而不能繼續加快反應速率。在加酶量為64 U/g時，反應達到飽和，反應體系處于平衡狀態。故加酶量64 U/g為最佳。

2.4 含水量對酶催化水解產生甘油二酯含量的影響

以ROL為催化劑，測定了水解產生的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨反應體系中含水量的變化，其結果見圖4。

脂肪酶是在油水界面上發揮催化作用的酶，水是維持酶活性的必備條件，含水量過低，則會影響酶分子表面的單分子層，使酶分子的構象和活性受到影響[15]，所以含水量是一個重要的影響因素。由圖4可知，隨著含水量的增加，酶解產物中甘油二酯的含量逐漸降低。這主要是因為酶促水解體系中液體酶中的水已經滿足酶的催化作用，多余的水打破了水—油界面的平衡，隨著水界面的增大,酶分子與油界面的接觸機會減少，催化效率下降。故后續試驗中不再向反應體系額外添加水。

圖4 含水量對酶解反應效果的影響Figure 4 Influence ofwater content on enzymatic hydrolysis

2.5 攪拌方式及轉速對酶催化水解產生甘油二酯含量的影響

以ROL為催化劑，分別測定了不同攪拌方式下水解產生的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨攪拌速度的變化，其結果見圖5和圖6。

圖5 恒溫振蕩箱振蕩速度對酶解反應效果的影響Figure 5 Influence of constant temperature vibrator agitation speed on enzymatic hydrolysis

圖6 磁力攪拌器轉子轉速對酶解反應效果的影響Figure 6 Influence ofmagnetic stirrer agitation speed on enzymatic hydrolysis

由圖5和圖6可知，在一定范圍內，隨著攪拌速度的增大，酶催化反應效率提高。這是因為攪拌速度的增大，增加了酶與水—油反應界面的接觸面積，從而提高了酶的催化效率。但隨著攪拌速度的進一步增大，反應效率反而降低，這可能是因為：①酶與反應界面的充分接觸，促使酶進一步催化甘油二酯水解為單甘脂和游離脂肪酸，從而使體系中甘油二酯的含量降低；②過高的轉速使轉子在攪拌過程中產生的不良剪切效應破壞了酶分子的空間構象，使其催化活性降低[16]。兩種不同攪拌方式的結果對比發現，振蕩箱進行攪拌時，1，3-二亞油酸甘油酯的含量不高，為16.96%。磁力攪拌要明顯優于恒溫振蕩箱攪拌，1，3-亞油酸甘油酯的含量為23.91%，提高了9.65%。這主要是因為磁力攪拌器轉子產生的剪切力使底物與酶的接觸更加均勻充分，從而提高了酶的催化效率。故選用磁力攪拌的方式，攪拌速度為500 r/min最佳。

根據HPLC-RID對最優條件下甘油二酯中各組分的檢測，通過不帶校正因子的面積歸一化法[17]算出甘油二酯的含量高達55.5%。馬傳國等[18]利用Novozym435酶，在6.5 h，85℃下甘油二酯的得率為50.44%，與此相比，ROL用時更短，溫度要求相對溫和，得率也相對更高，更具有實現甘油二酯商業化生產的潛力。

3 結論

(1)選用脂肪酶ROL催化大豆油水解產生甘油二酯，2.5 g大豆油中加入64 U/g ROL酶液，在磁力攪拌器的轉子轉速為500 r/min，反應溫度為30℃，反應時間為4 h的條件下，產物中1,3-二亞油酸甘油酯含量最高，為23.91%。

(2)該方法得到的產物中除了高含量的甘油二酯之外，還伴隨有游離脂肪酸和單甘酯的生成，這些物質的存在會影響富含甘油二酯的大豆油的穩定性，如何在原有的基礎上進一步促使這些物質轉化為甘油二酯，是接下來的研究方向和重點。

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