杜仲葉醋發酵工藝參數優化

賈春鳳 劉 愷 陳梅香

JIA Chun-feng LIU KaiCHEN Mei-xiang

（保定學院，河北 保定 071000）

(Baoding College,Daoding,Hebei071051,China)

當今，大量資料[1-5]顯示：醋已從單純的調味品逐漸成為藥療與食療俱佳的著名食品之一。目前保健醋的種類繁多。有棗醋[1]、蘋果果醋[2]、柿子醋飲[3]、岐山香醋[4]、楊梅果醋[5]、木瓜果醋[6]、胡柚果醋[7]等等。這些醋產品都是根據不同的原料來命名的，并根據其特性進行了工藝研究。特定的工藝針對特定的原料有利于保持原物料的特性及營養價值，從而更好地達到保健目的。

杜仲(eucommia ulmoides oliver)為杜仲科(eucommiace-ae)植物，是具有悠久使用歷史的名貴藥材，一般以皮入藥。研究發現，杜仲葉中含有的化學成分和杜仲皮中的極為相似、且二者具有相近藥理作用[8,9]，杜仲葉綠原酸含量為1.27%～4.06%[10]，杜仲葉中綠原酸含量相當豐富，因此，《中華人民共和國藥典》2005年將綠原酸定為評價杜仲葉質量優劣的主要技術指標[11]。中國杜仲資源豐富，但杜仲葉利用率較低，僅10%～20%[12]。

本試驗主要對以杜仲葉為主要原料的杜仲葉醋發酵工藝進行研究，可以充分利用中國杜仲葉資源。本試驗除了以傳統的糖、乙酸含量為發酵工藝測定目標外，還增添了綠原酸含量的檢測，更突出了杜仲葉醋的保健功能，同時為杜仲葉醋工業化生產提供技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉：陜西省漢中市略陽縣秋季老葉；

醋前發酵劑：上海佳民釀造食品有限公司；

纖維素酶：1×104U/g，北京奧博星公司；

95%的乙醇、乙腈、冰乙酸、氫氧化鈉：分析純，北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平：AB104-N型，上海第二天平儀器廠；

高效液相色譜儀，LC-20AT型，日本島津公司；

手持式糖量折光儀：WAY-32型，上海光學五廠；

分析天平：PL403型，梅特勒—托力多儀器(上海)有限公司；

恒溫水浴鍋：DSY-2-8型，北京國華醫療器械廠；

往復式水浴恒溫振蕩器：SHZ-88型，江蘇太倉市試驗設備廠。

1.3 方法

1.3.1 杜仲葉醋發酵工藝流程

1.3.2 單因素試驗設計 分別對不同的麩皮添加量、料液比、滅菌時間進行單因素試驗，以糖含量為指標，選擇正交試驗的因素水平。

1.3.3 正交試驗優化 根據單因素試驗結果，采用 L9(33)正交試驗設計，以糖含量和綠原酸含量為指標優化乙醇發酵前工藝條件。

1.3.4 乙醇發酵時間、乙酸發酵時間、葡萄糖添加量對杜仲葉醋發酵的影響 在1.3.3最優試驗條件下，測定乙醇發酵最佳時間、乙酸發酵最佳時間，發現發酵結果—乙酸含量低于國家標準，添加不同含量的葡萄糖，考察葡萄糖添加量對發酵結果—乙酸和綠原酸含量的影響。

1.3.5 杜仲葉醋品質評價 參照GB 18187——2000，對成品的感官指標、理化指標和衛生指標進行分析。

1.3.6 乙酸菌AS.14l懸液制備 參照文獻[13]。

1.3.7 綠原酸和乙酸測定方法

(1)綠原酸含量測定：高效液相色譜法測。迪馬C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈∶水∶冰乙酸(12∶88∶1)為流動相，檢測波長325 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進樣量5μL。將稀釋后的樣品測得峰面積代入已測方程：y=16 362x-137 670，R2=0.996 7，求得含量綠原酸。

(2)乙酸含量的測定：酸堿中和滴定法。具體操作：吸取0.1mL試樣置于試管中，加入3.9mL蒸餾水，充分震蕩混勻，用氫氧化鈉溶液（c(NaOH)=0.0050 mol/L或c(NaOH)=0.050mol/L）滴定至酚酞變色為滴定終點，記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數，可計算總酸含量。

1.4 數據處理

每組試驗重復3次，試驗數據用SPSS 17.0進行了處理和分析，最后取用平均值表示。用Sigmaplot 10.0作圖，試驗最終結果用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 酶解液中綠原酸含量的測定

根據方法1.3.1，測定本次酶解液中綠原酸的含量為(1.26±0.11)mg/mL。

2.2 乙醇發酵前工藝參數的選擇試驗結果

2.2.1 麩皮添加量的影響 在10 mL杜仲葉酶解液中加入不同質量分數的麩皮：0.5，1.0，1.5，2.0 g。121 ℃滅菌 30 min后冷卻，不加糖，未進行發酵，直接測定糖含量。由圖1可知，隨著麩皮添加量的增大，糖的含量呈現上升趨勢，在添加2.0 g麩皮時，經滅菌后樣品中液體存在量很少，添加量為0～1.0 g/10mL時，糖含量增加較快，添加量為1.5～2.0 g/10mL時，糖含量增加較慢，因此確定1.5 g/10mL麩皮添加量為本試驗最佳試驗參數。

圖1 麩皮添加量對糖含量的影響Figure1 Effectofbran addition on the contentofsugar

2.2.2 水添加量的影響 10 mL酶解液中添加1 g麩皮，0，5，10，20mL 蒸餾水，121 ℃滅菌 30min后冷卻，不加糖，未進行發酵，直接測定糖含量。由圖2可知，水的添加量對糖含量的影響相當大。隨著水添加量的增加，糖含量呈顯著下降趨勢，因此水的添加量為0mL時，只添加10mL杜仲酶解液時，糖含量最高。

圖2 水的添加量對糖含量的影響Figure2 Effectofwateraddition on the contentofsugar

2.2.3 滅菌時間的影響 10mL酶解液中添加1.5 g麩皮，在121 ℃下滅菌時間分別設為 15，20，30，40min，放涼，不加糖，未進行發酵，直接測定糖含量。由圖3可知，糖含量隨著加熱時間的延長少有增加，尤其是加熱40min比加熱30min的樣品中糖的含量只增加了0.2%。因此，取20，30，40min作為下一步試驗研究對象。

2.2.4 正交試驗結果與分析 根據單因素試驗設計的正交試驗因素及水平見表1，試驗設計及結果見表2。

由表2可知，料液比對糖含量影響最大，接著是麩皮的添加量，最后是滅菌時間。由于當麩皮添加量為2 g時，樣品中的液體含量已經很少，因此在本試驗中以糖含量為測定目標的正交試驗結果顯示乙醇發酵前最佳工藝：麩皮添加量為2 g，只添加10mL杜仲葉酶解液，滅菌時間為40min。結合單因素數據進一步分析可知滅菌30min時，糖的含量只比40min時少0.2%，本著在對糖含量影響不大，節約能源的原則，最佳滅菌時間定為30min。此時，綠原酸含量為 (0.6±0.022)mg/mL：

圖3 滅菌時間對糖含量的影響Figure3 Effectofhated time on the contentofsugar

表1 正交試驗因素及水平Table1 Factorsand levelsoforthogonal tests

在此最優工藝參數下，根據1.3.1工藝進行發酵，乙醇發酵在第4天，糖含量基本不變；乙酸發酵到第5天，乙酸含量開始下降，但第4天最高含量的乙酸小于1 g/100 mL，因此乙醇發酵前需要補糖。

2.3 乙醇發酵時間和乙酸發酵時間的確定及葡萄糖的添加量對乙酸發酵的影響

由表3可知，乙醇發酵到第3天時，各樣品中糖含量幾乎降到最低，因此乙醇發酵最佳時間為3 d。不添加葡萄糖時，樣品發酵到在第4天時乙酸含量達到最高，第5天開始下降；添加了2%和4%葡萄糖的發酵樣在乙酸發酵的第3天和第4天分別出現最高乙酸含量，雖然還是較低，但已達到GB 18187——2000中規定值（總酸≥3.5 g/100mL，以乙酸計）；和其他樣品比較，添加6%葡萄糖樣品在第4天時乙酸含量最高，并遠遠高于GB 18187——2000中規定值；并且，乙酸發酵到第4天時，各樣品中綠原酸含量變化幅度較小；因此乙酸最佳發酵時間為4 d，葡萄糖最佳添加量為6 g/100mL。

表2 正交試驗設計及結果Table2 Orthogonalarray design and results

表3 糖的添加量對杜仲葉醋乙酸的影響Table3 Effectofglucoseaddition on eucommiaulmoidesvinegar

由試驗結果可知，糖添加量能夠促使乙醇生成，有利于乙酸發酵；但隨著葡萄糖添加量的增加，其乙酸含量最高值出現時間逐漸延長，可能是高糖產生的高乙醇含量抑制了乙酸菌代謝形成乙酸，使之代謝減緩造成的[14]。綠原酸的含量卻隨著糖的添加量的增加而略有增加，這可能是綠原酸易溶于乙醇和乙酸的性質造成的，但整體變化不大。發酵到第4天時，添加6%葡萄糖樣品綠原酸的含量為0.61mg/mL。研究[15]表明，當綠原酸溶液綠中原酸含量為大于等于0.1mg/mL時對過氧化氫的最大清除率可達95.43%；對氧自由基和羥自由基清除效果較好較穩定，對脂質過氧化也有明顯的抑制作用。因此本最優工藝下的杜仲葉醋有較好的抗氧化功能。

2.4 產品質量指標

2.4.1 感官指標 色澤：紅棕色，透亮；香氣：醋香味和杜仲葉特有的藥香味；滋味：醋味鮮，略有淡淡的杜仲葉藥味；體態：純凈，無懸浮物，無雜質。符合GB 18187——2000規定。

2.4.2 理化指標 總酸(以乙酸計)為(4.46±0.05)g/100mL，綠原酸含量為(0.60±0.06)mg/mL，游離礦酸、總砷、鉛、黃曲霉毒素符合GB 18187——2000規定。

2.4.3 衛生指標 菌落總數≤100 CFU/mL，大腸菌群未檢出，致病菌未檢出，符合GB 18187——2000規定。

3 結論

本試驗以資源豐富的杜仲葉為主要原料，進行酶解；采用L9(33)正交試驗設計，分別考察了水添加量、麩皮添加量及滅菌時間對糖和綠原酸的影響；并考察乙醇發酵時間、乙酸發酵時間和葡萄糖添加量對乙酸和綠原酸含量的影響，確定最佳工藝為原料配比是麩皮質量∶葡萄糖質量∶杜仲葉酶解液體積為2∶0.6∶10，121℃滅菌30min；乙醇發酵最適時間為3 d；乙酸發酵最適時間為4 d，最終可得總酸(以乙酸計)為(4.46±0.05)g/100 mL、綠原酸含量為(0.60±0.06)mg/mL 的優質杜仲葉發酵醋。

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