柱前衍生-高效液相色譜熒光法測定人血漿中乙酰半胱氨酸及其生物等效性研究

張 樂，胡嵐嵐，周世文，湯建林

（第三軍醫大學新橋醫院國家藥物臨床試驗機構，重慶 400037）

0 引 言

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種巰基化合物，作為關鍵的生理物質廣泛存在于動物細胞和組織中。NAC不僅在細胞生物學，生物化學方面發揮重要功能，而且具有多種藥理作用，比如：溶解黏液，抗氧化，消炎，保護肝臟、心臟和神經細胞等[1-2]。NAC的臨床應用領域還在不斷拓寬，在藥物及重金屬中毒、腫瘤、艾滋病、帕金森病等過程中NAC都能起到一定預防、治療作用[3]。目前國內外關于巰基化合物測定方法的報道較多，包括熒光光度法[4]，氣相色譜質譜法[5]，離子色譜法[6]和高效液相色譜-紫外[7]、質譜[8]或電化學檢測法等。但上述方法在分析性能，成本，操作復雜性，樣品處理，靈敏度等方面多存在著種種不足。這些不足大大增加了實驗難度或成本，導致上述檢測方法難以應用于常規檢測和推廣。同時，有研究表明，熒光試劑衍生高效液相色譜熒光分析法在測定巰基化合物含量時，具有靈敏度高，操作相對簡單，易于自動化，特異性高等特點。據此，本研究采用 N-（1-芘） 馬來酰亞胺 （N-（1-Pyrenyl）maleimide，NPM）為熒光衍生試劑，設計、建立了柱前衍生-高效液相色譜熒光分析方法，用于人血漿中NAC濃度的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters-600E型高效液相色譜系統（配2475型熒光檢測器，717plus型自動進樣器及Millennium32色譜管理軟件，Waters公司）；色譜柱：Diamonsil C18柱（5μm×150mm×4.6mm，系列號 8013909，迪馬公司）；保護柱：C18柱芯（4mm×3.0mm，迪馬公司）；MC-210S型電子天平（精度0.01mg，Sartorius公司）；高速離心機（Abbott公司）；XH-86多用途旋渦混合器（江蘇阜寧縣羅橋校辦工廠）；Millipore超純水系統。

受試制劑：乙酰半胱氨酸咀嚼片（海南海神同洲制藥有限公司，規格：0.6g/片，批號：20071101）；參比制劑：乙酰半胱氨酸泡騰片（浙江康恩貝生物制藥有限公司，規格：0.6g/粒，批號：070828）；乙酰半胱氨酸對照品（純度99.5%，批號：20031001，海南海神同洲制藥有限公司）；N-（1-Pyrenyl）maleimide（NPM，含量 98%，Sigma公司）；Tetramethylammonium hydroxide pentahydrate（TMA，含量 98%，Alfa Aesar試劑，Johnson Matthey公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（Burdick＆ Jackson公司）；磷酸（分析純，重慶川東化學試劑廠）；磷酸二氫鈉（分析純，重慶北碚化學試劑廠）；三乙胺（含量≥99.5%，Fluka公司），試驗用水均為Millipore超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 流動相的配制

精密稱取0.78 g磷酸二氫鈉于500mL容量瓶中，用超純水定容，即得10mmol/L溶液，經0.45μm的水性濾膜過濾后于室溫保存即可。

1.2.2 標準溶液的配制

精密稱取NAC 6.4mg，用乙腈溶解定容至50mL，即得128μg/mL的NAC標準儲備溶液。精密稱取NPM 44.7mg，用乙腈溶解定容至100mL，即得1.5mmol/L NPM儲備溶液，4℃冰箱保存備用。取NAC儲備液用乙腈對半稀釋至濃度分別為 64.0，32.0，16.0，8.0，4.0，2.0μg/mL的標準工作液；取上述1.5mmol/L NPM溶液1mL于50mL容量瓶中，乙腈定容至即得30μmol/L NPM衍生溶液，4℃冰箱保存備用。

1.2.3 血漿樣品的處理及衍生化反應

取血漿樣品100μL于1.5mL離心試管中，加入800μL NPM衍生液，渦旋1min，室溫反應5min后，加50%乙酸中止反應，10500 r/min離心3min，取上清20μL進樣。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱；流動相：乙腈－10mmol/L NaH2PO4（含TMA 10mmol/L，H3PO4調pH至3.4）為50∶50。流速：1mL/min；激發波長：330nm，發射波長：380nm；柱溫：30℃。進樣量為20μL。

1.2.5 方法驗證

本文對高效液相色譜熒光法進行了線性、定量下限、精密度、回收率、穩定性的驗證。

2 結 果

2.1 分離特性

在上述色譜條件下，分別考察了7個不同來源的空白血漿，空白血漿+標準品、標準品及實測樣品的色譜分離情況，測得NAC色譜圖如圖1所示。由圖可見，被測物峰形良好，無雜質峰干擾，血樣中NAC的保留時間為3.8min。

2.2 標準曲線和線性范圍

取上述配置好的NAC工作液50μL于0.95mL血漿中，按血漿處理方法配制成血漿濃度為：6.58，3.29，1.64，0.82，0.41，0.20，0.10 μg/mL 的溶液進樣分析，每個濃度平行2份。每一濃度進樣20μL。記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程：y＝9.91×105x+4.47×104（r=0.9945，n=3，各點 RSD＜12%，見表 2），線性范圍為 0.1～6.58μg/mL，血漿中 NAC 定量下線為 0.1μg/mL（S/N=5，0.101±0.002，RSD=2.3%，n＝5）。

2.3 回收率試驗

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各 5份，按照1.2.3“血漿樣品處理”項下步驟操作，進樣分析，計算得低、中、高3種濃度的NAC的相對回收率（n=6）分別為94.8%、93.1%、90.7%；變異系數分別為3.8%、8.7%、6.0%。結果表明，低、中、高3種濃度的相對回收率均符合要求，方法準確可靠。結果見表1。

2.4 精密度試驗

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各 5份，按照1.2.3操作，在1 d內不同時間處理測定，考察日內精密度；連續3 d于同一時間配制0.20，1.64，6.58μg/mL NAC血樣各5份，處理測定，考察日間精密度。結果見表2。

表2 乙酰半胱氨酸精密度試驗

2.5 穩定性試驗

2.5.1 血漿樣品處理后室溫放置的穩定性

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各兩份，-80℃冰箱放置凍存，按照1.2.3“血漿樣品處理”項下操作，于 0，1，2，3，4，6，12h 測定，每個濃度平行 2份?？疾煅獫{樣品處理后室溫放置的穩定性，其結果見表3。由表可見，血漿樣品可于室溫下至少保存12h（RSD＜11.3%）。

2.5.2 凍融穩定性

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各兩份，-80℃冰箱放置凍存，然后在室溫融化，融化后的樣品在同樣條件下重新冷凍。按照1.2.3操作，于每個凍融循環測定，每個濃度平行兩份?？疾?次凍融循環血樣的穩定性，其結果見表3。由表可見，血漿樣品凍融3次仍穩定（RSD＜12.8%）。

2.5.3 血漿樣品冰箱凍存的長期穩定性

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各 14份，-80℃冰箱放置凍存，按照1.2.3操作，于0，1，2，3，6，7，10 d 測定，每個濃度平行兩份?？疾煅獫{樣品長期凍存的穩定性，其結果見表3。由表可見，血漿樣品可于-80℃冰箱至少保存10d（RSD＜12.6%）。

表3 乙酰半胱氨酸穩定性試驗

2.6 實測樣品結果

男性健康受試者20名，完全隨機分成兩組，每組10人，分兩個階段采用雙交叉給藥方案，分別口服被試制劑和參比制劑 1.2g，于給藥前和后 15，30，45，60，75min，1.25，1.5，2，2.5，3，4，6，8 h 抽取上肢靜脈血3mL，分離血漿，柱前衍生-HPLC熒光檢測法測定人血漿中NAC濃度，所得數據經BECS軟件處理，統計分析。20名受試者口服參比之際和受試制劑1.2g后，NAC不同制劑的平均血藥濃度-時間曲線圖見圖2。

受試制劑與參比制劑NAC的Tmax分別為（1.35±0.59），（1.47±0.72）h，Cmax分別為（3.76±1.35），（3.80±1.48）μg·mL-1，用梯形法計算所得的 AUC0-t分別為（8.13±2.35），（8.40±2.23）μg·h·mL-1，AUC0-∞分別為（9.62±2.60），（10.03±2.64）μg·h·mL-1。對經對數轉換后的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞進行方差分析和雙單側T檢驗及90%可信限判斷，受試制劑的Cmax落在參比制劑的80.39%～123.99%范圍內,受試制劑的AUC0-t落在參比制劑的82.70%～112.20%范圍內，AUC0-∞落在參比制劑的83.14%～111.16%范圍內，對Tmax經Wilcoxon檢驗，無顯著差異，受試制劑NAC咀嚼片AUC0-t的相對生物利用度為（101±34）%，AUC0-∞ 為（103±40）%，符合生物等效性規定要求。

圖2 20名健康受試者分別口服1.2g受試制劑和參比制劑后乙酰半胱氨酸血藥濃度均值-時間曲線

3 結束語

曾經使用高效液相熒光法測定人血漿中NAC含量，試用了固相萃取法處理血漿樣品或調整流動相比例的辦法用以克服空白血漿對樣品測定的干擾，但效果不佳。故在隨后的實驗中選擇柱前衍生高效液相熒光法來進行測定，在此條件下，雜質峰對樣品峰干擾小，保留時間適宜。

NAC本身是一種強大的抗氧化劑，其分子式中的活性巰基（-SH）很容易被氧化為二聚物或與生物基質中的內源性巰基以混合二聚物形式存在。因此，NAC在生物樣品中不穩定。在實驗過程中發現NAC的血漿樣品在－80℃冰箱中保存6h后，NAC含量發生明顯改變；在室溫條件下放置1 h后，含量也開始降低。鑒于此，需要引入一種衍生試劑，通過衍生反應增強NAC在生物樣品中的穩定性。NPM作為一種衍生試劑，與巰基的衍生步驟非常簡單（不需要任何特殊試劑，反應在室溫下孵育5min即可完成），且衍生后的樣品相對穩定。衍生化反應式見路線圖3。因此，在實驗中選擇了NPM對獲得的血漿樣品立即進行衍生化處理，并將衍生后的樣品在-80℃條件下保存。隨后，在10日內完成檢測。

圖3 NAC衍生化反應式

試驗結果表明，本法符合化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術指導原則。且本法簡便易行，靈敏度較高，重現性好,生物樣本中內源性雜質對測定不產生干擾，可用于該藥的生物樣本中含量的測定。

通過對20名健康志愿者采用隨機、雙交叉試驗，比較NAC咀嚼片及泡騰片的相對生物利用度。結果顯示，NAC咀嚼片和泡騰片各主要藥動學參數均無顯著性差異，認為受試制劑與參比制劑間具有生物等效性。

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