在線固相萃取-高效液相色譜檢測功能飲料中VB12

陳淑芬，郭麗萍，金燕

1(蘭州石化職業技術學院 石油化學工程系，甘肅，蘭州，730060)2(賽默飛世爾科技中國有限公司應用研究中心北京實驗室，北京，100080)

VB12又稱鈷胺素，是一種水溶性維生素［1］。VB12以輔酶形式參與代謝過程，促進DNA和蛋白質的合成，促進細胞的成熟，維持神經組織的正常功能，缺乏VB12時會產生惡性貧血、神經系統的損害［2］。VB12的主要來源是動物性食物，如動物肝臟、牛肉、豬肉、蛋、牛奶、乳酪，而VB12的含量非常微量，添加維生素的飲料中含量僅為0.2～20 μg/L。含量過低，是用高效液相色譜法測定飲料中VB12含量的難題［1］。

目前，文獻報道的VB12測定方法主要有微生物法［3］、熒光法、高效液相色譜法［4］、凝膠色譜-高效液相色譜法等。而微生物法操作繁瑣，時間較長;熒光法穩定性不夠好;現有的高效液相色譜法僅適用于測定含量高的預混料;凝膠色譜-高效液相色譜法使用的凝膠凈化柱特異性較強，但價格昂貴［1］。國家標準GB/T 5009.217－2008保健食品中VB12的測定雖列于適用于功能性飲料檢測，方法檢出限為3 μg/L，但采用的是免疫親和柱，成本高，且對于飲料中添加量低于1.0 μg/L的樣品按取樣25 mL進行檢測，檢出限仍達不到要求。也有文獻報道使用離線固相萃取-高效液相色譜法對微量VB12進行離線除雜及濃縮后再進行檢測［1，5］。

本文利用雙泵技術、閥切換技術和在線固相萃取技術，通過在線固相萃取柱的特殊選擇性保留VB12和部分干擾物，在線將絕大多數干擾物質排出，然后通過閥切換使用另一個泵將VB12反沖到分析柱上進行檢測。方法操作方便、靈敏度高、耗時短、重現性強，對VB12的檢出限可以達到 0.54 μg/L，回收率達101.29%。該方法具有很好的可操作性，可以用于功能飲料等復雜液體樣品中VB12的檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品

市售功能性飲料。

1.2 主要試劑

VB12(J＆K，對照品，純度 98%);乙腈(Thermofisher，HPLC 級);三氟乙酸(Dikma，HPLC 級，純度99.5%);實驗用水均為電阻率為18.2 MΩ cm的去離子水。

1.3 儀器及設備

Ultimate 3000雙梯度高效液相色譜(Thermofisher，美國)，包括雙泵(DGP)模塊、自動進樣器(AS)模塊、柱溫箱(TCC)模塊;雙泵模塊中包含2個獨立的三通道梯度泵，可分別用于梯度洗脫進行樣品分析;柱溫箱模塊中放置在線固相萃取柱和分析柱，溫度設為30℃，并置一個二位十通閥，可用于流動相和柱子之間的切換;檢測器是二極管陣列檢測器(Thermofisher Ultimate 3000);Chromeleon 7.1色譜工作站(Thermofisher，美國);超純水設備(Barnstead，Thermofisher，USA)。

1.4 溶液的制備

1.4.1 標準品溶液和樣品溶液的配制

精確稱取42 mg的VB12標準物質，使用超純水溶解并定容至25 mL，制成1 680 mg/L濃度的VB12標準品溶液，并依次稀釋成 1.05、3.15、5.04、10.08 及20.16 μg/L 濃度的 VB12標準品溶液，分別經 0.45 μm的濾膜過濾后裝瓶，待測。

將功能飲料經過2層0.45 μm的濾膜過濾后裝瓶，待測。

1.4.2 色譜條件

在線固相萃取色譜柱:Thermofisher IonPac NG1柱(4 mm ×35 mm)。

分析色譜柱:Thermofisher Acclaim PAII C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)。

采用梯度淋洗，在線固相萃取色譜柱條件見表1，分析色譜柱條件見表2，閥切換時間見表3，儀器連接見圖1。檢測波長為220 nm。柱溫30℃。進樣體積為 1 000 μL。

圖1 儀器連接圖Fig.1 Graph of HPLC connection

表1 測定功能飲料中VB12在線固相萃取柱的梯度淋洗程序Table 1 Gradient conditions of SPE column for determination of Vitamin B12in Functional Drink

表2 測定功能飲料中VB12分析柱的梯度淋洗程序Table 2 Gradient conditions of analysis column for determination of Vitamin B12in Functional Drink

表3 測定功能飲料中VB12的閥切換程序Table 5 Valve switching conditions for determination of Vitamin B12in Functional Drink

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 檢測波長的選擇

在200～600 nm對VB12標準品的光譜吸收進行掃描，結果顯示，λ=220 nm時，VB12有較大吸收，所以選擇220 nm為檢測波長。

2.1.2 色譜柱的選擇

由于VB12在反相色譜柱上保留能力很強，所以選用C18機制的Thermofisher Acclaim PAII色譜柱作為分析柱，選用乙腈及0.025%三氟乙酸水溶液作為洗脫液進行梯度洗脫。

由于VB12在功能飲料中的含量一般在10 μg/L左右，濃度比較低，如果直接進行高效液相色譜分析，需要增大進樣體積才能檢測到該濃度的VB12，可能會超出色譜柱的承受范圍，導致色譜柱壽命減短，而且由于飲料中大量的干擾物質存在，很難對該濃度下的VB12進行準確的檢測。如果對功能飲料樣品中的VB12進行離線反相固相萃取處理后，會很大程度上富集樣品并降低干擾，但是處理起來比較繁瑣，耗時。

本方法在固相萃取原理的基礎上，采用Thermofisher雙梯度液相色譜儀器特有的雙泵技術和在線閥切換技術對樣品進行在線固相萃取后進入分析柱進行分析，過程中避免了手動操作的誤差及節省了離線處理的步驟，操作簡單(在線固相萃取結果見圖2)。

圖2 在線固相萃取后功能飲料與標準品對比圖(1為10 μg/L VB12標準品結果，2為功能飲料檢測結果)Fig.2 Chromatography overlaid of Functional Drink with standard addition and standard with online SPE HPLC

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性、線性范圍及重現性

按照在線固相萃取方法優化后的液相色譜條件，進樣體積可以增大到1 000 μL，對VB12標準品分析，所得檢出限(S/N=3)、線性范圍數據列于表4。該方法用于VB12的檢測，靈敏度高，VB12的檢出限在0.54 μg/L(1 000 μL進樣);線性范圍較寬(1.05～20.16 μg/L)。由于每次分離結束后增加了一定時間的色譜柱平衡程序，大大提高了測定結果的重現性，VB12(濃度為10.08 μg/L)連續5次進樣時保留時間的RSD＜0.01%，連續5次進樣峰面積的RSD＜0.9%，具體數據列于表5。

2.2.2 回收率考察

在功能飲料樣品中加標制成加標10 μg/L VB12的功能飲料樣品，按照改進后的在線固相萃取色譜方法進行檢測，得到回收率可達101.29%，說明在線固相萃取過程中，基本上沒有造成VB12的損失，此在線固相萃取方法可以用于實際飲料中VB12的檢測。

2.3 樣品測定

精確量取樣品適量，按1.4.1條件處理樣品后，再按照1.4.2色譜條件測定樣品中VB12含量。結果顯示，功能飲料中含有5.6 μg/L的VB12，在功能飲料的標識含量范圍內。

表4 VB12的檢出限及線性范圍Table 4 Detection limits and linearity of Vitamin B12

表5 10.08 μg/LVB12的重現性數據Table 5 Repeatability data of 10.08 μg/L VB12

3 討論

本文根據Thermofisher IonPac NG1色譜柱對于VB12和干擾物的選擇性不同，選擇Thermofisher IonPac NG1色譜柱作為在線固相萃取柱，將VB12和少量干擾物保留在在線固相萃取柱中，大部分干擾物被排除，然后通過另一個泵將被保留的VB12和少量干擾物反沖到分析柱中進行分析，很大程度上降低了干擾，增加了靈敏度，檢出限達到0.54 μg/L。本文使用雙泵和閥切換技術將在線固相萃取技術應用于功能飲料中的VB12的檢測，VB12的回收率達101.29%。該方法具有很好的可操作性，可以用于功能飲料等復雜液體樣品中VB12的檢測。

［1］ 周芳梅，蔡雙福，文燦，等.固相萃取-高效液相色譜法測定飲料中維生素B(12)［J］.現代食品科技，2010，26(7):759－762.

［2］ 羅祎，郝常明.VB12的研究及其進展［J］.中國食品添加劑，2002(3):15－19.

［3］ GB 5413.14－2010.食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定［S］.

［4］ GB/T 17819－1999.維生素預混料中維生素B12的測定高效液相色譜法［S］.

［5］ 李紅艷，王瑾，邵亮亮，等.固相萃取-高效液相色譜法測定功能性飲料中微量維生素B-12［J］.浙江農業科學，2012(3):384－386.