耐鹽乳酸菌和酵母菌強化技術對高鹽稀態發酵醬醪品質的影響*

崔瑞迎，鄭佳，何菲，張立強，楊松彰，黃鈞，吳重德，周榮清，2，3

1(四川大學輕紡與食品學院，四川成都，610065)2(國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州，646000)3(四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，四川成都，610065)

醬油中復雜的營養及風味物質主要源于微生物對原料中蛋白質、淀粉及脂肪等的代謝作用［1］。不同種屬微生物生理特性的差異是導致釀造醬油品質區別的主要因素之一。不同耐鹽乳酸菌及酵母菌代謝生成的不同醇類、酯類賦予醬油不同的風味［2－4］。隨著現代生物技術的發展，傳統發酵食品的發展面臨著前所未有的機遇和挑戰，近年來，利用各種微生物菌株純培養物或不同菌株混合培養物強化食品發酵已成為應用生物技術改造傳統食品發酵業研究熱點。Akolka等［5］應用 Halobacterium sp.改善魚醬油產品質量的研究表明，將該菌懸液接種到醬醪中，不僅可明顯縮短發酵周期，也顯著改善魚醬油風味。Yin等［6］在泡菜生產過程，應用Lb.pentosus和Leu.Mesenteriodies的共培技術顯著降低了泡菜中亞硝酸鹽的含量，同時使腸球菌等腐敗菌的數量顯著減少，產品風味和質量也有較大改善。本文首次報道了純培養耐鹽乳酸菌T.halophilus CGMCC 3792、主發酵酵母菌Z.rouxii CGMCC 3791和產香酵母菌C.versatilis CGMCC 3790對冷溫釀造工藝［3］醬醪釀造過程中酸、醇、酯和酚等4類揮發性組分以及乙醇、4-乙基愈創木酚等醬油特色揮發性組分的影響規律，研究結果對認識乳酸菌、酵母菌的代謝作用及微生物共培改善醬醪品質具有重要借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 微生物

米曲霉(Aspergillus oryzae)滬釀3.042:上海迪發釀造生物制品有限公司;酵母菌Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791和Candida versatilis CGMCC 3790:本實驗室從百年老字號釀造企業的醬醪中分離，經26S rDNA和ITS區域序列測序、鑒定、命名并保藏于CGMCC;乳酸菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792:本實驗室從百年老字號釀造企業的醬醪中分離，經形態、生理生化特性試驗后經16S rDNA測序鑒定，保藏于CGMCC。

1.2 材料

大豆、小麥，本地農貿市場購買。

1.3 主要儀器與設備

醬醪發酵罐:不銹鋼罐，自制，容積10 L;DHP-9162電熱恒溫培養箱:上海一恒科學儀器有限公司;酸度計:PHS-3C精密pH計，上海精密科學儀器有限公司;固相微萃取頭:CAR/PDMS(75 μm，Supelco，美國);氣-質聯用儀:Trace GC Ultra DSQ II(Thermo，美國)，配備HP-5MS(30.0 m ×250 μm ×0.25 μm，Agilent，美國)毛細管色譜柱。

1.4 實驗方法

1.4.1 醬醪制備

［7］所述方法與步驟，將米曲霉滬釀3.042培養成麩曲種子，等比例加入蒸大豆、碎炒小麥，培養醬油曲。(1)濃度為25%的鹽水冷卻至5℃后，按1.8∶1(質量比)與醬油曲混合均勻，維持品溫≤15℃，發酵30 d后，將品溫逐漸提升至30℃，保溫發酵，樣品簡稱AC;(2)工藝條件同(1)，發酵起始時，接入T.halophilus CGMCC 3792的菌懸液，其菌體濃度為5×107CFU/g，樣品簡稱AL;(3)工藝條件同(1)，發酵3 d時，接入Z.rouxii CGMCC3791菌懸液，其菌體濃度達4.5×106CFU/g，隨后發酵4 d，接入C.versatilis CGMCC 3790菌懸液，其菌體濃度為5.5×106CFU/g，樣品簡稱 AY。

1.4.2 揮發性組分的測定

(1)樣品前處理:在檢測前，冷凍的醬醪樣品迅速用乳缽研磨至均勻醬狀。

(2)測定方法及GC-MS條件:揮發性組分的萃取參考文獻［8］采用 HS-SPME。GC-MS條件:初始溫度40℃，保持5 min，以4℃/min升至100℃，然后以6℃/min升至220℃，保持8 min;進樣口溫度250℃;載氣流速為1.0 mL/min;載氣為高純氦;離子源溫度、連接口溫度分別為230℃和250℃;EI電子能量為70 eV;質量掃描范圍為35～400 amu。

(3)揮發性組分的鑒定及數據處理:待測樣品的質譜圖通過與標準譜庫(NIST05)比對鑒定，匹配度大于800(最大值為1 000)的結果才予以報道。使用X-caliber軟件系統對結果數據進行處理，采用峰面積歸一化法確定各組分相對含量。揮發性組分相對含量以平均值±標準偏差(RSD)(n=3)。

2 結果與討論

2.1 耐鹽乳酸菌和混合酵母菌強化對醬醪揮發性組分的影響

圖1中分別是發酵初始以及發酵125 d后的各醬醪利用HS-SPME/GC-MS檢出的總離子流圖譜。由圖知，經125 d發酵后各醬醪揮發性組分的總離子圖譜較初始醬醪有顯著差異，且T.halophilus CGMCC 3792強化、混合Z.rouxii CGMCC 3791和C.versatilis CGMCC 3790強化對揮發性組分貢獻作用差異明顯。3種不同樣品共檢出45種揮發性組分，包括酸類(2種)、醇類(5種)、酯類(17種)、酮類(2種)、醛類(5種)、酚類(3種)、呋喃類(2種)、吡嗪類(2種)、其他(7種)等9類組分(表1)。與對照組醬醪相比，2種不同強化方式的醬醪中酸、醇、酚、呋喃和其他等5類組分的相對含量差異較大，而其余4類組分的相對含量接近。因釀造方法不同，本研究檢出的組分中，除2-甲基丁酸、戊酸、乙醇、2-甲基丁醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、4-乙基愈創木酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、大馬酮等19種組分外，其余組分與Sun等人［9］的結果稍有不同。

圖1 醬醪揮發性組分總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in soy sauce moromi

酸、醇、酯等組分具有各自獨特的香味［10］，其相對含量的不同將賦予醬醪不同的風味。AL中酸、醇、酮、呋喃、吡嗪和其他等6類組分的相對含量降低，酯、醛和酚等3類組分的相對含量增加(表1)。酚類組分的增加主要源于4-乙基愈創木酚相對含量的增加，4-乙基愈創木酚是醬油中重要的風味組分之一，是耐鹽酵母的代謝產物［11］，迄今未見是T.halophilus的代謝產物。但是，AL中4-乙基愈創木酚的相對含量從4.29%提高到 11.19%，增加了1.6倍。T.halophilus CGMCC 3792純培養物強化改善了棲息在醬醪中酵母菌的代謝環境有利于促進4-乙基愈創木酚的形成，還是乳酸菌自身代謝生成4-乙基愈創木酚，有待進一步探討。酯類組分小幅增加，其中乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等組分的相對含量顯著增加，辛酸甲酯和己酸正己酯等組分的相對含量降幅較大。醇類組分中苯甲醇、苯乙醇相對含量增幅較大，又因其抑制了醬醪中酵母菌繁殖與代謝，使得乙醇等組分的相對含量減少。其他組分相對含量的降低則是萘、甲基萘和2，6－二叔丁基苯醌減少所致。就單組分而言，T.halophilus CGMCC 3792的強化作用使揮發組分中苯甲醇、苯乙醇、乙酸乙酯、3-(甲硫基)-丙酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲醛、4-乙基愈創木酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2，3-二氫苯并呋喃等的相對含量增加，且苯甲醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲醛、4-乙基愈創木酚等提高的相對含量大于30%。苯甲醛的焦糖味［12］、3-(甲硫基)-丙酸乙酯的黃瓜和水果香味［13］有益醬油獨特風味的形成，4-乙基愈創木酚是醬醪的重要呈香物質之一，其相對含量的增加突出了醬醪的特殊香味。

AY中因Z.rouxii CGMCC 3791使乙醇發酵作用增強，抑制了雜菌的生長繁殖，其酸類組分的相對含量降低，醇類組分相對含量增加，尤其是苯乙醇的相對含量增高。酯類組分中乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯組分的相對含量顯著增加，長鏈脂肪酸乙酯(月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯等)也有一定幅度增加，雖然苯乙酸乙酯等組分有所降低，但與AL相比，酯類組分仍有較大增幅。AY中戊酸、2-甲基丁醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、苯乙醛等相對含量增幅較大，且酯類多是大分子酯類，在賦予其酯香和醬香風味方面具有重要的作用。2-甲基丁醇具有水果香氣(閾值為 16.0 μg/L)，1-辛烯-3-醇具有濃郁的蘑菇香氣(閾值為 1.5 μg/L)［14－15］，癸酸乙酯(閾值為 200 μg/L)賦予醬油水果香氣并帶有舒適的醋味［16］。

對照組的醬醪中2-甲基丁酸、乙醇、乙酸異戊酯、辛酸甲酯、苯乙酸乙酯、糠醛、二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮、四甲基吡嗪的相對含量較高。此外，在AL中并未檢出鄰苯二甲酸異辛酯和大馬酮，而在其他兩種醬醪中均有檢出，苯甲醛二甲縮醛在AL、AY中檢出，而對照組并未檢出。由此可見，不同種類微生物菌株純培養物強化醬醪發酵對改善醬油的風味有不同的改善作用。

表1 醬醪揮發性組分相對峰面積百分數Table 1 Relative peak area of volatile compounds in soy sauce moromi

續表1

2.2 主體組分、乙醇及4-乙基愈創木酚變化規律的研究

比較醇、酯、醛、酚等4類組分發酵過程的變化趨勢(圖2)知，從0 d至95 d的發酵過程中，3種類型醬醪中醇類組分呈現非單調增加的規律，AY較其他組變化顯著，其中AL醇類組分變化最平緩(圖2a)。酯類組分的變化為，在發酵初始階段均減少，AY發酵15 d后迅速升高，35 d后增至小峰值，隨后又減少，75 d時降至低谷，然后急速回升增大。對照組醬醪呈類似的變化規律，但發酵55 d時進入小低谷，隨后呈現單調增加的變化趨勢。AL則是發酵15 d時降至低谷，后稍有升高，穩定后呈現單調增加的變化規律(圖2b)。分析醛類組分的變化規律知，2種強化方式醬醪的變化規律類似，發酵第55天時達到峰值，隨時間延長，其相對含量逐漸減少，這可能與酯類及乙醇等組分的相對含量升高有關，對照組醬醪的變化幅度則相對較小(圖2c)。3種類型醬醪的酚類組分的變化類似(圖2d)，均呈升高-降低-趨于穩定的變化趨勢，只是AL降幅較小，AY的降幅較大且迅速。

圖2e和圖2f分別表示3種不同類型醬醪乙醇和4-乙基愈創木酚在125 d發酵過程中的變化規律。乙醇呈非單調增加的變化趨勢，且AL中，乙醇在整個階段的變化幅度低于其他組。4-乙基愈創木酚則呈現單調增加的變化規律，在發酵125 d時，AL較其他組的相對含量顯著增加。由此可見，對于T.halophilus CGMCC 3792是否具有分泌4-乙基愈創木酚的能力以及是否冷溫工藝賦予該菌株合成4-乙基愈創木酚的能力需進一步探究。

圖2 醬醪主體揮發性組分、乙醇及4-乙基愈創木酚的變化Fig.2 Changes of main volatile compounds，ethanol and p-ethylguaiacol in soy sauce moromi

3 結論

基于HS-SPME/GC-MS檢測冷溫釀造工藝AL和AY揮發性組分的研究結果表明，兩種強化方式均使醬醪中酸類、呋喃和吡嗪類組分的相對含量降低，酯類和醛類組分的相對含量增加。二者區別在于，AL中醇類、酮類及其他組分的相對含量降低，而酚類組分的相對含量增加，AY中酚類組分的相對含量降低，醇類及其他組分的相對含量增加。對于酯類組分，AL中乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯組分的相對含量顯著增加，辛酸甲酯和己酸正己酯的相對含量降幅較大，而AY中辛酸甲酯的相對含量降幅較大，而其長鏈脂肪酸乙酯的相對含量增幅較大。此外AL中4-乙基愈創木酚的相對含量大幅提高，且整個發酵過程中也單調增加，需進一步探究其原因。

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