戊糖乳桿菌素pentocin LPEM818的初步純化及特性研究*

于雷雷，王超，施波，馬妙蓮，段慧，張明

(安徽農業大學生命科學學院，安徽合肥，230036)

細菌素(bacteriocin)是一些細菌產生的抗菌多肽或蛋白［1］，因其能被人類胃腸道分泌的蛋白酶降解，對人體無毒副作用，所以具有作為食品生物防腐劑的潛在應用價值，乳酸乳球菌素nisin在乳制品及罐頭制品中已得到了廣泛的應用［2］。戊糖乳桿菌 (Lactobacillus pentosus)［3］是公認的食品安全菌，因而對戊糖乳桿菌細菌素戊糖乳桿菌素進行了大量研究，有關戊糖乳桿菌素的報道最早見于1999年有關pentocin TV35b的分離純化［4］，我國在2004年首次報道了pentocin 31－1的分離純化［5－9］。已報道的產細菌素戊糖乳桿菌有 L.pentosus TV35b［4］、L.pentosus 31 －1［5－9］、L.pentosus ST151BR［10］、L.pentosus B96［11］、L.pentosus ST712BZ［12］、L.pentosus S-PT84［13］、L.pentosus b240［14］、L.pentosus IG1［15］、L.pentosus［16］、L.pentosus C50-6［3］、L. pentosus 191 和 L. pentosus 204［17］等。

戊糖乳桿菌素多屬于II類細菌素，分子量較小、熱穩定性高、主要抑制革蘭氏陽性菌［4］，但pentocin C50-6還能抑制革蘭氏陰性菌［3］，在N-末端具有 IIa類細菌素的保守序列YGNGV，對單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19115有較強的抑制作用［5］。L.pentosus B96和L.pentosus IG1所產的IIb類細菌素均由2個高度疏水、對熱穩定的小分子肽組成，2個組分在抑菌功能上具有協同作用［11，15］。Pentocin C50-6 由于沒有進行序列測定，僅根據分子量和抑菌譜的分析推測其可能屬于抑菌譜較廣的I類或II類細菌素［3］，暫未發現屬于IIc類、IId類、III類和IV類的戊糖乳桿菌素。細菌素的抑菌方式一般分為抑菌、殺菌不溶菌和殺菌且溶菌3種類型，研究表明現已報道的pentocin TV35b和pentocin 31-1對指示菌的的作用方式均為殺菌不溶菌［4－5］。戊糖乳桿菌素由于可耐受高溫處理，且大部分在酸性或弱堿性條件下穩定［2－9］，因而在食品領域具有廣泛的應用前景。本文主要探討了戊糖乳桿菌LPEM818細菌素的生物學特性以及對指示菌的作用方式等，以待為該細菌素的應用和進一步研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

產細菌素菌株:戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)LPEM818為安徽農業大學生命科學學院實驗室篩選保藏;指示菌株見表2。

1.1.2 培養基

MRS培養基和 LB培養基［18］。

1.1.3 主要藥品試劑

胃蛋白酶(BBI)，木瓜蛋白酶(Sangon)，脂肪酶(Sigma)，過氧化氫酶(Sigma)，凝乳蛋白酶(BBI)，胰蛋白酶(BBI)，蛋白酶K(Sigma)，Sephadex G-25(GE Healthcare)，BSA(BBI)，Folin-酚試劑(Sangon)，尿素(BBI)，EDTA(BBI)，SDS(BBI)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 Pentocin LPEM818的活性及效價的測定

采用牛津杯雙層平板法［19］和雙層平板二倍稀釋法［20］。

1.2.2 蛋白質濃度的測定

Lowry 法［21］。

1.2.3 Pentocin LPEM818 的初步純化［22］

接種6環菌株LPEM818于MRS培養基中，37℃培養14 h作為種子液。按4%的體積比將種子液接種于4 L MRS培養基中，37℃培養24 h。將發酵液離心，過濾(0.45 μm)，上清液進行80% 硫酸銨沉淀，4℃過夜，離心取沉淀，重懸于 ddH2O中，用透析袋(500 u)透析脫鹽，經氯化鋇檢測不含硫酸銨，收集透析液，測定其效價并冷凍干燥，得到 pentocin LPEM818干粉。將pentocin LPEM818干粉重懸于ddH2O，得到效價為1 060AU/mL的樣品，取5 mL上Sephadex G-25(1.6 cm×100 cm)凝膠層析，流速為0.6 mL/min，流動相為ddH2O。收集各峰進行活性檢測，確定其活性峰。

1.2.4 Pentocin LPEM818的生物學特性研究

1.2.4.1 pH值和熱穩定性實驗

樣品用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調pH值至 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 和 12.0，補加 ddH2O 使樣品終體積相等，以ddH2O同比稀釋的樣品作為對照，每組設3個平行，37℃水浴6 h后，調 pH值至5.0，檢測其抑菌活性。

樣品分別進行 4、37、60、80、100 和 121℃水浴 15 min或30 min，以未經處理的樣品為對照，每組設3個平行，冰浴10 min后檢測其抑菌活性。

1.2.4.2 酶和有機溶劑敏感性實驗

樣品用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調至各酶最適pH值，使各酶的最終濃度為5 mg/mL，以ddH2O同比稀釋的酶和同比稀釋的樣品分別作為對照，每組設3個平行，37℃水浴8h，沸水浴10 min，檢測抑菌活性。

樣品分別加入1%體積比的 SDS、尿素、NaCl、EDTA、Triton X-100、吐溫-80和乙腈，以 ddH2O 同比稀釋的有機溶劑和同比稀釋的樣品分別作為對照，每組設3個平行，37℃水浴4h，檢測抑菌活性。

1.2.4.3 抑菌譜的測定

采用牛津杯雙層平板法，分別對供試G+菌株和G－菌株做抑菌實驗。

1.2.4.4 作用方式的測定

將菌株533接種于LB培養基中，37℃培養14 h(OD600=2.89)作為種子液，按4%的體積比接種于LB培養基，分成兩組，一組在8h后加入 pentocin LPEM818樣品，另一組加等體積的無菌生理鹽水作為對照，37℃培養26 h，每2 h取出5 mL，測定OD600，計算菌落數(CFU/mL)，每次測3個平行。

1.2.4.5 生理曲線的測定

將菌株LPEM818的種子液按4%的體積比接種于MRS培養基中，37℃培養。每隔2 h取樣，測定OD600，pH值和上清液抑菌活性，各設3個平行。

2 結果與分析

2.1 Pentocin LPEM818的初步純化

為了對pentocin LPEM818進行初步純化，本實驗以80%硫酸銨沉淀樣品為材料，進行了Sephadex G-25(1.6 cm×100 cm)凝膠層析分析(圖1)。上樣量為5 mL，流速為0.6 mL/min，流動相為 ddH2O，收集各峰并測定活性。

圖1 Sephadex G-25層析圖譜Fig.1 The chromatogram of G-25

經G-25凝膠層析后，樣品有2個峰(圖1)，抑菌實驗證實第2個峰為活性峰，而第1個峰無抑菌活性，為雜蛋白峰，達到了一定的分離效果。說明硫酸銨沉淀分離法用于初步分離該細菌素是可行的。經過硫酸銨沉淀和G-25層析分離純化后，該細菌素的純化倍數為11.09倍，回收率為6.4%(表1)。經Tricine-SDS-PAGE電泳后，出現多條蛋白質條帶(結果未顯示)，分子質量在6.5～27 ku，說明該細菌素為小分子肽。可能由于樣品上樣量太少，導致未檢測到有抑菌活性的條帶;要獲取單一條帶，有待進一步優化分離純化條件。

2.2 Pentocin LPEM818的pH值和熱穩定性實驗

對80%硫酸銨沉淀樣品分別在不同的pH值條件下，37℃水浴6 h后，調pH值至5.0，檢測抑菌活性，以獲得該細菌素的pH穩定性范圍。相同樣品經不同的溫度處理15 min或30 min，冰浴10 min，檢測抑菌活性，以獲得該細菌素的熱穩定性范圍。

表1 Pentocin LPEM818的純化表Table 1 Purification table for pentocin LPEM818

pH穩定性實驗結果(圖2)表明，樣品在pH 4.0～6.0條件下抑菌活性最高，其保留值約為90%，在pH 2.0和8.0條件下抑菌活性仍保留在80%，當pH在10.0或12.0時抑菌活性完全喪失。因此，該細菌素具有較好的酸和弱堿穩定性。熱穩定性實驗結果(圖3)表明，樣品經4～80℃處理后，抑菌活性保留在90%以上。經100℃處理30 min和121℃處理15 min后，抑菌活性保留在80%以上，而經121℃處理30 min后，其抑菌活性仍保留在66.98%。因此該細菌素是一種熱穩定型的細菌素。

圖2 不同pH對樣品抑菌活性的影響Fig.2 The antibacterial activity of sampleat the different pH

圖3 不同溫度對樣品抑菌活性的影響Fig.3 The antibacterial activity of sample at the different temperature

2.3 Pentocin LPEM818對酶和有機溶劑的敏感性實驗

對80%硫酸銨沉淀樣品分別經不同的酶在37℃條件下處理8 h，沸水浴10 min，檢測抑菌活性，以確定該細菌素的酶敏感性。相同樣品經不同的有機溶劑在37℃條件下處理4 h，檢測其抑菌活性，以確定該細菌素的有機溶劑敏感性。

對酶敏感性實驗結果(圖4)表明，樣品經蛋白酶K和胰蛋白酶處理后抑菌活性完全喪失，所以對其敏感;樣品經凝乳蛋白酶處理后抑菌活性下降15%，所以對其較敏感;樣品經脂蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后抑菌活性基本不變，所以對其不敏感，因此該細菌素為蛋白類抑菌物質。對有機溶劑敏感性實驗結果(圖5)表明，樣品經尿素處理后抑菌活性下降14%，所以對其較敏感;樣品經 Triton X-100、NaCl、吐溫-80和乙腈處理后抑菌活性不變，所以對其不敏感;該細菌素與SDS或EDTA共同作用時，抑菌效果明顯好于單一作用，因此二者具有協同抑菌作用。

圖4 不同酶對樣品抑菌活性的影響Fig.4 The antibacterial activity of sample at the different enzymes

圖5 不同有機溶劑對樣品抑菌活性的影響Fig.5 The antibacterial activity of sample at the different organic solvent

2.4 Pentocin LPEM818抑菌譜的測定

用80%硫酸銨沉淀樣品分別對供試的G+菌株和G－菌株做抑菌實驗(表2)，測定抑菌圈直徑，以確定該細菌素抑菌譜。

表2 Pentocin LPEM818的抑菌譜Table 2 Antibacterial spectrum of pentocin LPEM818

硫酸銨沉淀樣品的抑菌譜測定結果(表2)表明，pentocin LPEM818對供試的G－菌株變形桿菌、雞白痢沙門氏菌、綠膿桿菌和G+菌株單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、四聯球菌的抑制作用明顯;對糞腸球菌、發酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、短乳桿菌等近源乳酸菌也有較好的抑制作用。

2.5 作用方式的測定

圖6 Pentocin LPEM818對S.pullorum533的作用方式Fig.6 The effect of pentocin LPEM818 on the growth of S.pullorum 533

將接種過菌株533的LB培養基置于37℃培養，每隔2 h取樣，測定其OD600值，監測菌體濃度的變化，同時測定CFU監測活菌數量，獲得菌體的生長情況(圖6)，以確定該細菌素對指示菌的作用方式。

對菌株533作用方式的研究(圖6)表明，菌體在12 h后進入生長穩定期。實驗組菌株533的活菌數在10 h，從1×108降至1×107，隨后趨勢略有下降。說明細菌素在短時間內殺死了大量指示菌，該細菌素對指示菌的作用方式為殺菌。而對照組活菌數則呈持續上升趨勢，10h后保持穩定;實驗組菌株533的OD600在10 h后基本保持恒定，說明該細菌素對指示菌無溶菌現象;而對照組OD600一直呈上升趨勢，直至16 h后穩定。因此，該細菌素對指示菌的作用方式僅為殺菌。

2.6 生理曲線的測定

將接種過菌株 LPEM818的 MRS培養基置于37℃培養，每隔2 h取樣，測定OD600值，pH值和上清液抑菌活性，以測定該菌株的生理曲線。

菌株LPEM818生理曲線的測定結果(圖7)表明，菌株LPEM818置于37℃培養，6 h進入對數中期，16 h進入穩定期，此時OD600值最大，22 h進入衰亡期。發酵上清液的pH值從6.24降至4.50，18 h后保持恒定。在對數期中期開始產生細菌素，且在穩定期后期產量達到最大值，此時抑菌活性達到最高，隨后保持穩定，整個過程受pH的影響較小。

圖7 L.pentosus LPEM818的生理曲線Fig.7 Production of pentocin LPEM818 during growth of L.pentosus LPEM818

3 討論與結論

3.1 Pentocin LPEM818的初步純化

細菌素的分離純化與其特性研究密切相關。細菌素的初步分離方法有鹽析法、有機溶劑沉淀法和pH吸附法等，進一步純化方法有凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水相互作用層析和反相高效液相色譜等。本研究采用硫酸銨沉淀和Sephadex G-25凝膠層析對pentocin LPEM818進行了初步純化，最終純化倍數為11.09倍，但回收率僅為6.4%，說明純化過程中目的蛋白損失較大。今后應繼續對pentocin LPEM818的分離純化條件進行優化，為將來的精細純化及應用奠定基礎，但是根據其目的蛋白峰，確定了硫酸銨沉淀法樣品用于生物學特性研究的可行性。

3.2 Pentocin LPEM818的作用方式

細菌素通常對敏感菌株的作用方式表現為3種類型:抑菌、殺菌不溶菌和殺菌且溶菌。本研究在S.pullorum 533的菌懸液中加入80%硫酸銨沉淀樣品后，在短時間內對S.pullorum 533的活菌數產生了有效的抑制作用，并且在加入該細菌素后OD600無明顯變化，因此該細菌素對S.pullorum 533的作用方式僅為殺菌。具有與本實驗結果相同作用方式的細菌素有 bacTN635［23］和 plantaricin MG［24］，其中 bacTN635的指示菌活菌數下降了6個單位，而OD600無明顯變化;plantaricin MG的指示菌活菌數下降了96.3%，而OD600也無明顯變化。而 plantaricin TF711［25］的指示菌活菌數在3h內下降了1.3個單位，隨后有所上升，9h后保持穩定，其作用方式為抑菌。所以pentocin LPEM818比bacTN635或plantaricin MG的抑菌效果稍差，但優于plantaricin TF711。

3.3 Pentocin LPEM818的生物學特性

細菌素的生物學特性決定其潛在的應用價值。Pentocin LPEM818在pH 2.0～8.0條件下穩定，具有酸和弱堿穩定性的特點，與enterocin LR/6在pH 2.0－8.0條件下抑菌活性保留80%［26］基本相同，但其熱穩定性不及pentocin LPEM818。Pentocin LPEM818在121℃處理30 min仍保留67%的抑菌活性，具有較好的熱穩定性。具有相似特性的pentocin 31－1在100℃處理 15 min只保留 50%的抑菌活性［7］。pentocin LPEM818熱穩定性明顯優于pentocin 31－1。pentocin LPEM818對酶的敏感性的特點與Pediococcus pentosaceus CFR SIII所產的細菌素相似，僅對胰蛋白酶和蛋白酶K敏感［27］，但其pH穩定性范圍為3.0～5.0明顯差于本細菌素。對吐溫-80、NaCl、乙腈和 Triton X-100不敏感，對尿素敏感的特點與sakacin LSJ618［28］相一致，進一步表明了該細菌素具有蛋白屬性。EDTA或 SDS本身對S.pullorum 533具有抑制作用，pentocin LPEM818與SDS或EDTA共同作用時，抑菌效果明顯好于單一作用，因此二者有協同抑菌作用［28－30］。在實驗條件下，菌株 LPEM818在對數中期開始產生細菌素，在穩定期后期產量達到最大值，隨后保持穩定，產細菌素過程受環境pH的影響較小。該細菌素對供試的大部分G+菌株和G－菌株均具有較強抑制作用，其抑菌譜廣，對多數致病菌和食品腐敗菌抑菌作用明顯，特別是對Listeria monocytogenes ATCC19115和G－菌株較強的抑制作用，所以其具有作為食品生物防腐劑的潛在應用價值。

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