魚油納米脂質體的制備及其性質測定*

涂宗財，張朋，王輝，尹月斌，滿澤洲

1(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌，330047)2(江西師范大學生命科學學院，江西南昌，330022)

魚油因其富含ω-3型多不飽和脂肪酸而成為一種重要的功能食品，比如α-亞麻酸(C18:3n-3)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。臨床研究已經證實，ω-3型脂肪酸有促進大腦發育、降低患心血管疾病的風險、抗炎抗腫瘤等生理作用［1-3］。然而，由于ω-3型脂肪酸極易發生氧化，這給它的功能性作用帶來了較大影響。運用微膠囊化技術能夠有效提高魚油的氧化穩定性和貯藏時間，同時微膠囊的緩釋作用可以提高其消化吸收利用率［4］。

脂質體是微膠囊技術向縱深的發展，通常指由磷脂構成的雙層膜球形小泡，可以包埋親水性、親脂性或兩親性的藥物、營養因子［5］。作為一種載體，其優點有:可以同時包埋親水性和疏水性物質，在水中的分散性較好;主要壁材磷脂是生物膜的組成成分之一，生物相容性好，毒性小，安全性高;能夠保護被包埋物質，并起到緩釋作用［6］。目前，脂質體技術已經在醫藥領域得到成熟應用，近年來已有學者關注其在功能食品領域的應用，主要包括了對中鏈脂肪酸、抗氧化、抗菌活性成分和維生素等物質的包埋［7-9］。脂質體的制備方法比較多，常見的有薄膜分散法［10］，乙醇注入法［11-12］，逆向蒸發法［13］，凍融法［14］等，這些方法或多或少存在產品粒徑較大、穩定性差、有毒有害溶劑殘留等缺點。基于這些原因，為了使脂質體技術能在食品領域安全、規模化的應用，對傳統制備方法進行改進將具有重要意義。

動態高壓微射流技術使流體在振蕩頭中達到300 m/s以上的速度分成2股或更多股細流，然后在極小空間進行強烈的垂直撞擊或Y型撞擊，在撞擊的過程中瞬間釋放出其大部分能量，產生巨大的壓力降，從而使得液體顆粒高度破碎，能有效降低流體中固體顆粒的粒徑，并且可以實現連續化生產［15］。目前，還未見將乙醇注入法和動態高壓微射流技術相結合制備脂質體的報道，本研究運用乙醇注入-動態高壓微射流法制備魚油納米脂質體，優化了其制備工藝，并對魚油納米脂質體的儲存穩定性進行了初步研究;避免了有毒有害溶劑的使用，有效的降低了脂質體的平均粒徑和多分散指數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚油，南京森海生物油脂廠，EPA+DHA＞30%;卵磷脂、膽固醇，上海藍季科技發展有限公司;吐溫-80，天津市大茂化學試劑廠;甲醇、無水乙醇、正己烷、石油醚(沸程60～90)，均為分析純;磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 6.8，0.05 mol/L)。

1.2 儀器與設備

V-1001旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司;Microfluidizer Processor M-110EH微射流儀，美國Microfluidics公司;NICOMP380/ZLS納米粒度分析儀，美國PSS粒度分析儀公司;TGL-10C高速離心機，上海安亭科學儀器廠;UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司;H-600透射電鏡，日本日立公司;JD200-3B電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司;透析袋(14 000D)國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乙醇注入-動態高壓微射流法制備魚油納米脂質體

將類脂材料(大豆卵磷脂、膽固醇和魚油)以一定比例溶解于無水乙醇中，然后用注射器將其注入到溶有一定量吐溫-80的pH 6.8的 PBS緩沖液中，在40℃條件下，利用旋轉蒸發儀使懸浮液中乙醇完全揮發，即得到粗脂質體［11-12］。將粗脂質體用動態高壓微射流儀在不同壓力條件下處理不同次數，即可得到魚油納米脂質體。運用同樣的方法在不添加魚油的條件下制備空白脂質體。

1.3.2 魚油納米脂質體包封率的測定

1.3.2.1 吸收波長的確定

將魚油、膽固醇和磷脂分別溶解在石油醚中配成0.6 mg/mL的溶液，取適量上述3種溶液分別放入比色皿中，以石油醚為空白對照，用UV-2450紫外分光光度計在200～400 nm波長處分別掃描3種溶液。

1.3.2.2 標準曲線的繪制

配制一系列不同濃度魚油石油醚溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)，以石油醚為空白，在1.3.2.1測得的最佳波長處測定魚油石油醚溶液的吸光度，以魚油的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2.3 魚油納米脂質體包封率的測定

取20 mL脂質體于透析袋中透析16 h除去游離魚油，精密量取10 mL透析內液，選用甲醇為破乳劑，用超聲破壁(30 min，功率100 W)，加入石油醚提取，于4 000 r/min離心6 min，取上清液于容量瓶中用石油醚定容，在1.3.2.1測得的最佳波長處測定其吸光度，魚油脂質體吸光度為A，空白脂質體吸光度為A0，計算 ΔA(ΔA=A-A0)，根據 1.3.2.2 得到的線性回歸方程求出包封的魚油質量［16-17］;由公式(1)計算得出包封率。

1.3.3 乙醇注入-動態高壓微射流法制備魚油納米脂質體的工藝優化

以包封率為指標，影響魚油納米脂質體包封率的因素較多，對各個單因素做了考察，脂質濃度(10、20、30 、40、50、60 mg/mL)，磷脂與膽固醇質量比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)，磷脂與魚油的質量比(20∶1、10∶1、10∶2、10∶3、10∶4)，磷脂與吐溫-80 的質量比(20∶1、15∶1、10∶1、10∶2、10∶3)，微射流壓力(80、100、120、140、160 MPa)，微射流次數(0、1、2、3、4、5)。在單因素實驗的基礎上，通過極差分析，選取了磷脂濃度、磷脂與魚油的質量比、微射流處理壓力、微射流處理次數4個對包封率影響較顯著的因素，采用四因素三水平的響應面分析方法求取最佳工藝參數，實驗因素與水平設計見表1。

表1 實驗因素水平及編碼Tabel 1 Codes and levels of factors chosen for the trials

1.3.4 魚油納米脂質體粒徑和Zeta電位的測定

用Nicomp380/ZLS納米激光粒度分析儀測定。將最佳工藝制備的納米脂質體懸浮液稀釋一定倍數，測定平均粒徑和Zeta電位，樣品平行測定3次。

1.3.5 魚油納米脂質體的形貌觀察

運用負染色法對脂質體懸浮液進行透射電鏡觀察:用蒸餾水將脂質體樣品稀釋到大約10 mg/mL，將稀釋后的樣品與20 g/L磷鎢酸以體積比1∶1混合放置2～3 min，將銅網浸入上述液體，并用濾紙吸干多余液體，待自然晾干后，在放大倍率60 000×，工作電壓為75kV的透射電鏡下觀察魚油納米脂質體的形態［18］。

1.3.6 魚油納米脂質體穩定性考察

取最佳工藝條件制備的魚油納米脂質體，分別儲存在-18、4和25℃條件下，考察其包封率和粒徑隨儲存時間的變化趨勢。

2 結果與分析

2.1 最佳吸收波長的選擇和標準曲線的繪制

如圖1所示，雖然在吸收波長為214 nm處，魚油石油醚溶液有最大吸收峰，但磷脂、膽固醇石油醚溶液在此處也有較強吸收;在274 nm處魚油石油醚溶液有較大吸收峰，磷脂、膽固醇石油醚溶液吸收峰較弱，因此選擇274 nm作為測定魚油納米脂質體包封率的吸收波長。在此波長下，按照1.3.2.2的方法得到魚油石油醚溶液的線性回歸方程為A=1.197X+0.031 9，R2=0.997 4。

圖1 魚油、磷脂、膽固醇石油醚溶液的紫外掃描曲線Fig.1 Ultraviolet scanning spectrum of fish oil、soybean phosphatidylcholine and cholesterol

2.2 響應面優化實驗結果

進行Box-Behnken的四因素三水平實驗設計，對實驗數據進行回歸性分析，建立數學模型，得到制備魚油納米脂質體的最佳工藝條件。響應面實驗設計方案與實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計與實驗結果Table 2 Response surface design and test results

2.3 模型的建立及顯著性分析

對表2中的數據進行多元回歸擬合，得到磷脂濃度(A)、磷脂與魚油的質量比(B)、微射流壓力(C)、微射流處理次數(D)與包封率(Y)之間的二次多項回歸方程:Y=72.5+2.95A+3.47B+11.54C+1.50D-1.20 AB+1.30AC+0.05AD-1.22BC+0.55BD-0.10CD-4.52A2-7.91B2-7.21C2-5.92D2。對該回歸模型進行方差分析，結果見表3。

根據統計學知識對方差表進行分析，回歸方程模型P值＜0.000 1，說明所選用的二次多項模型高度顯著;模型相關系數R2=0.972 8，僅有2.3%的響應值總變異不能由此模型解釋，說明該模型能較好地描述實驗結果;實驗失擬項不顯著，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析;變異系數(CV)為3.7%，說明實驗有良好的穩定性;綜合分析說明可以用此模型來分析和預測乙醇注入—動態高壓微射流法制備魚油納米脂質體的工藝結果。模型一次項 A、B、C、D 和二次項 A2、B2、C2、D2差異都是顯著的，說明所選因素與響應值兩者不是簡單的線性關系。F值可以反映各因素對實驗指標的重要性，F值越大，表明對實驗指標的影響越大［19］，由表3可知各因素的主次順序為:微射流壓力＞磷脂與魚油的質量比＞磷脂濃度＞微射流處理次數。

2.4 響應曲面分析及最優條件的確定

響應曲面越陡峭，表明操作條件對響應值的影響越顯著;等高線趨于橢圓則反映2個因素交互作用顯著。如圖2-C中曲面陡峭程度最大，表明微射流處理壓力、魚油與磷脂質量比這2個因素對包封率的影響比較大，這與單因素的實驗結果一致;圖2-A中等高線呈明顯的橢圓形，表明磷脂濃度和魚油與磷脂質量比這2個因素交互作用明顯。

根據所得模型，預測最優工藝條件為:磷脂濃度29.1 mg/mL，磷脂和魚油質量比 10∶2.2，微射流壓力152.5 MPa，微射流次數2.1次，在此條件下包封率的理論值為77.8%。考慮到實際操作的便利，將工藝參數修正為:磷脂濃度29 mg/mL，磷脂和魚油質量比10∶2，微射流壓力150 MPa，微射流處理次數2次，在此條件下進行3次重復實驗，得到平均包封率為76.9%，與理論預測值相比，其相對誤差約為1.2%，說明響應面優化得到的實驗參數具有一定的實用價值。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

圖2 不同因素交互作用對魚油納米脂質體包封率的影響Fig.2 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of different conditions on encapsulation efficiency of fish oil nanoliposomes

2.5 魚油納米脂質體粒徑與Zeta電位

粒徑分布通常作為衡量納米脂質體穩定性的一個重要指標，由圖3得知，最佳工藝條件下脂質體的平均粒徑為 128.1 nm，多分散指數(PDI)為 0.258。在相同配方條件下，未經過動態高壓微射流處理的脂質體的平均粒徑為 442.6 nm，PDI 0.901。PDI值越小，表明粒徑分布范圍越狹窄，粒度的均勻性也越好;脂質體的Zeta電位為-20.11 mV，Zeta電位大意味著脂質體雙分子膜表面帶有的電荷越多，聚集時需要克服的靜電斥力就越大，較大的Zeta電位可以阻礙脂質體溶液中的微粒發生凝聚［11，18］。因此，根據粒徑、PDI和Zeta電位的測定結果可以初步預測魚油納米脂質體具有較好的穩定性。

圖3 魚油納米脂質體的粒徑分布圖和Zeta電位Fig.3 Diameter distribution and Zeta potential of fish oil nanoliposomes

2.6 魚油納米脂質體的形貌觀察

透射電鏡觀察表明乙醇注入—動態高壓微射流法制備的魚油納米脂質體為球形或橢球形，外觀平滑完整，無明顯塌陷和凝聚成團，顆粒分布較均勻。

圖4 魚油納米脂質體的透射電鏡圖Fig.4 TEM micrograph of fish oil nanoliposomes

2.7 不同儲存溫度下魚油納米脂質體穩定性考察

由圖5可知，魚油納米脂質體在25℃儲存條件下粒徑隨時間延長顯著增大，發生了聚集，包封率顯著降低，魚油出現了泄漏情況，這可能是因為高溫條件下磷脂氧化加劇，造成脂質雙分子層結構出現了破損，從而使魚油滲漏。條件為-18℃時，在第1周內脂質體的包封率降低較明顯，這主要是因為冰晶的形成和升華破壞了磷脂的膜結構，因此在將脂質體溶液進行凍干時，有必要添加一定量的凍干保護劑［20］。4℃時脂質體粒徑和包封率變化較小，表明在該條件下脂質體具有較好的穩定性。

3 結論

(1)利用乙醇注入-動態高壓微射流法制備魚油納米脂質體的最佳工藝條件為:磷脂濃度29 mg/mL，磷脂與膽固醇質量比4∶1，磷脂與吐溫-80的質量比10∶1，磷脂和魚油質量比 10∶2，微射流壓力 150 MPa，微射流處理次數2次，在此條件下脂質體的包封率為76.9%。

(2)在最佳工藝條件下脂質體的平均粒徑為128.1 nm，多 分 散 指 數 (PDI)0.258，Zeta 電 位-20.11 mV。透射電鏡觀察到脂質體為球形或橢球形，外觀平滑完整。在4℃儲存條件下脂質體具有較好的穩定性。

圖5 不同儲存溫度條件下粒徑和包封率隨時間的變化趨勢Fig.5 The changing trends of particle size and encapsulation efficiency with various times under the conditions of different storage temperatures

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