黃酒中生物胺的形成及其影響因素*

張鳳杰，薛潔，王異靜，王德良，周建弟，謝廣發

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)2(浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興，31200)

黃酒是以谷物為原料，由多種微生物(霉菌、酵母和細菌)共同參與釀制而成的一種低酒精度發酵酒，是中華民族的國粹之一。作為中國特有的傳統酒種，其獨特的開放式多菌種發酵技術，完全不同于葡萄酒等采用單一菌株發酵的飲料酒，多菌種發酵雖然造就了黃酒酒體風味醇厚、豐滿、完整和馥香的特點，但發酵過程復雜且難以控制，易產生一些潛在的有害物質，生物胺就是其中之一［1－5］。

生物胺是一類堿性含氮化合物，因其潛在的毒性作用和對生產衛生條件的指示作用而受到消費者、制造商和研究者的關注。食用含高濃度生物胺的食品后，會引起一系列不良反應，如頭痛。其中組胺的毒性最大，其次是酪胺。口服8～40 mg組胺會產生輕微中毒癥狀，超過40 mg會產生中等中毒癥狀，超過100 mg會產生嚴重中毒癥狀;酪胺的最大攝入量為100～800 mg/kg，超過1 080 mg/kg會引起嚴重中毒。哺乳動物的腸道和消化道具有一定的解毒功能，在酶的作用下單胺或多胺的氨基被氧化，從而達到解毒的作用，但酒精和乙醛抑制這些酶的活性［6－10］。

目前，對黃酒生物胺的研究多集中于檢測分析方面，對黃酒釀造過程中生物胺的產生和影響因素分析報道較少。根據資料報道，我國葡萄酒中生物胺含量在6.34～39.05 mg/L之間，啤酒中生物胺含量范圍為2.20 ～42.03 mg/L［11］，而黃酒中生物胺的平均含量卻達到115 mg/L［1］，因此，黃酒中生物胺含量遠遠高于葡萄酒和啤酒。作為中國民族特色產品，我國黃酒產品國際市場占有率極低，因此如何提高黃酒質量安全水平，加強黃酒安全監控，是提高我國黃酒產品國際競爭力的關鍵之一。本研究通過分析原料、菌種、發酵工藝及貯存時間對黃酒中生物胺含量的影響，探究黃酒生物胺含量的變化規律，為進一步控制黃酒中生物胺含量提供了理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及儀器設備

1.1.1 實驗材料

糯米、麥曲、酒母、發酵醪、黃酒樣品，由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供。

1.1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(Agilent1100，Perkin Elmer Series 200，配紫外檢測器);離心機;旋渦混合器;恒溫箱;氮吹儀;超聲波清洗器;分析天平(精確至0.000 1 g);pH計;超純水器;0.45 μm針頭微孔濾膜過濾器。

1.1.3 主要化學試劑

8種單體生物胺標樣(色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺)，18 種氨基酸標樣，1，7二氨基庚烷(內標)，丹磺酰氯(衍生劑)，均為Sigma公司產品;異硫氰酸苯酯，三乙胺，三氯甲烷，正丁醇，正己烷，三氯乙酸，丙酮，甲醇，乙腈，均為色譜純。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品前處理和生物胺測定方法：

參照GB/T 5009.208－2008食品中生物胺含量的測定［12］。

1.2.2 氨基酸的測定方法

采用PITC柱前衍生高效液相色譜法［13］。

1.2.3 酒精度、總酸、的測定

參照GB/T13662－2008黃酒國家標準［14］。

1.2.4 細菌計數方法

采用細菌平板菌落計數法，將黃酒發酵液梯度稀釋至 10－5，10－6，10－7，分別接種于改良 MRS 固體培養基上［15］，30℃厭氧培養2 d后進行計數。

1.3 感官品評

1.3.1 品評人員

國家級或省級黃酒評委。

1.3.2 品評依據

根據理化指標初步確定候選的批次和缸別，取上清液，分別裝在三角瓶中，在電爐上加熱至剛沸騰并有大氣泡，移去熱源，稍冷后倒入各組(6個)酒杯中;通過品評人員對其澄清度和感官品質進行評價來劃分質量。即澄清度好則發酵成熟，渾濁或產生沉淀則發酵尚不成熟;口味以暴辣、爽口、無異味為佳［16］。

1.4 數據處理

應用Origin8.5作圖和SPSS10.0進行相關性分析和單因素方差分析，P＜0.05視為差異顯著。

2 結果分析

2.1 原料和糖化發酵劑中生物胺含量及影響分析

紹興黃酒釀造是以糯米為原料，以塊曲和熟曲為糖化劑，以速釀酒母(機械化新工藝黃酒)或淋飯酒母(傳統工藝黃酒)為發酵劑。本研究選取黃酒釀造用水、3種不同產區的粳糯米、3種不同產區的秈糯米、3種麥曲、7種淋飯酒母和1種速釀酒母共18個樣品，檢測其生物胺含量，結果如表1、表2所示。

表1 黃酒釀造原料中生物胺含量mg/LTable 1 Content of biogenic amines in glutinous rices mg/L

從表1結果可以看出:水中不含生物胺;糯米中僅檢出腐胺、尸胺和精胺3種脂肪族生物胺，它們的產生與衛生條件密切相關［17］。生物胺總量范圍為0.14～6.01 mg/kg，其中腐胺含量比和檢出率最大，尸胺僅在粳糯米3中檢出。3種粳糯米中生物胺含量差異顯著(P＜0.05)，3種秈糯米無顯著差異。

從表2結果可以看出:曲中檢出少量生物胺，總含量不超過1.00 mg/kg，其中腐胺含量比和檢出率最大;酒母中除組胺和酪胺在少量樣品中未檢出外，8種胺均被檢出，且不同酒母生物胺含量差異顯著(P＜0.05)，變化范圍為16.43～87.72 mg/L。腐胺是酒母中的主要生物胺，含量占19.83～68.23%，差異極顯著(P＜0.01)。色胺在淋飯酒母中的平均含量為12.16 mg/L，酪胺僅為3.72 mg/L。

表2 黃酒釀造不同曲和酒母中生物胺含量mg/LTable 2 Content of biogenic amines in“wheat Qu”and seed starters mg/L

續表2

按照黃酒機械化生產的原料配比和表2中總量平均值計算，糯米、曲、酒母帶入黃酒的生物胺約為1.22 mg/L、0.11 mg/L、6.03 mg/L，因此，酒母帶入前酵罐的生物胺總量最大，其次是糯米，曲帶入的極少。

酒母的優劣是決定黃酒釀造中發酵好壞的關鍵，也與黃酒風味有著重要的關系。成熟的淋飯酒母需經過挑選后才能使用，通常采用化學分析和感官鑒定相結合的方法進行挑選:發酵正常、酒精度15%以上、總酸6.1g/L以下、爽口無異味的淋飯酒母為優良酒母。同樣，酒精度9.0%以上、總酸4.1g/L以下的速釀酒母為成熟酒母［16］。8種不同酒母的化學分析和感官鑒定結果見表3，7種淋飯酒母中生物胺總量與總酸、酒精度和感官品評的相關性分析結果見表4。

表3 不同酒母的化學分析和感官鑒定Table 3 The chemical analysis and sensory analysis of seed starters

表4 淋飯酒母中生物胺總量與總酸、酒精度和感官品評的相關性分析Table 4 The correlation analysis between content of biogenic amines and total acid，alcohol，sensory analysis

結果表明，生物胺總量與總酸含量呈正顯著相關，與酒精度和感官品質呈負顯著相關，其中與總酸和酒精度的相關性極顯著，這說明總酸較低、酒精度偏高、感官品評好的淋飯酒母中生物胺含量較少。所以，挑選良好的淋飯酒母不僅能夠保證生產的順利進行，而且也是控制發酵前生物胺含量的關鍵措施之一。

2.2 黃酒發酵過程中生物胺含量變化及因素分析

傳統的黃酒釀造工藝是以陶制的大缸和陶壇為發酵容器，攤飯操作、手工開耙，全開放式發酵。前酵在大缸中進行，發酵到約第4天將發酵醪分裝到陶壇中，進行緩慢的后發酵，發酵期長達70～80 d。機械化的黃酒釀造工藝用發酵罐代替了陶缸和陶壇，機械設備代替了手工操作，控溫發酵，發酵時間縮短到20 d左右。本研究分別跟蹤兩種工藝發酵過程中生物胺含量的變化，結果見圖1所示。

圖1 傳統和機械化工藝發酵過程生物胺總量變化曲線Fig.1 Change of biogenic amines content duiring two kinds of different fermentation processes

圖1顯示，2種不同工藝釀造過程中生物胺總量均呈先上升后下降的趨勢。機械化工藝在第6天達到最高值，總量的增加表現為前急后緩，發酵結束后生物胺總量是發酵前的286.21%。傳統工藝發酵過程，發酵第2天生物胺總量已經很高，到15 d時達到最大值，此值比機械化工藝最大值高27.8 mg/L，之后呈降低趨勢，發酵結束后生物胺含量為110.07 mg/L，與機械化工藝發酵結束時生物胺含量(104.18 mg/L)大致相同。另外本研究分析結果表明，腐胺是黃酒中的主要生物胺，占生物胺總量20.46% ～54.43%(機械化工藝)，31.74% ～50.13%(傳統工藝);酪胺是另一個主要生物胺，機械化黃酒中最高含量為(50.70±2.32)mg/L，傳統工藝為65.66±2.01 mg/L，其他生物胺在2種不同工藝黃酒中也存在差異，如色胺的差異很大，在傳統工藝黃酒中相對較高，最高含量為(37.68±2.04)mg/L，而在機械化工藝中僅為(10.81±1.75)mg/L，可能與傳統工藝中更為復雜的微生物群落有關。

生物胺是由相應前體物氨基酸在脫縮酶作用下經過脫羧反應轉化而來［18］，因此前體物濃度影響生物胺的含量，本研究跟蹤了黃酒發酵過程中生物胺和氨基酸變化，如圖2所示。

黃酒發酵過程中氨基酸含量的變化是一個動態過程:一方面，蛋白酶不斷水解蛋白質成氨基酸，并且在發酵后期，酵母等微生物自溶后內容物析出，氨基酸含量增加;另一方面酵母生長發酵，消耗部分氨基酸，但從圖2結果可知，在發酵過程中黃酒中氨基酸含量呈顯著的上升趨勢，而酪胺等生物胺均呈現先增多后降低，這從一定程度上說明黃酒中氨基酸含量多少不是限制生物胺合成的條件;對前6天酪胺和酪氨酸變化情況進行相關性分析，相關系數r=0.974*，P=0.005，這僅能說明發酵前6 d兩者成線性正相關;而從氨基酸總量和生物胺總量來看，并無相關性。因此，可以判斷黃酒發酵過程中氨基酸含量豐富，不影響生物胺的生成，這與張輝［19］的研究結論相一致。

圖2 酪胺與酪氨酸，生物胺總量與氨基酸總量變化曲線(氨基酸總量以10 mg/L為單位計算)Fig.2 Change of tyramine and tyrosine content(a)，change of biogenic amines and amino acids content(b)

乳酸菌是發酵過程中影響生物胺含量的另一個關鍵因素［18，20］，黃酒發酵醪中乳酸菌主要是來自酒母和麥曲，少部分從器具和環境中接入［16］。由于乳酸菌是黃酒釀造中的主要細菌［19，21］，本研究分析了機械化黃酒發酵過程中細菌數量的變化情況，如圖3所示。

圖3 機械化工藝發酵過程中細菌數目變化曲線Fig.3 Changes of bacterial count in mechanized fermentation process

結果顯示，發酵前2 d細菌數量急劇增多;但隨著酒精度、總酸的升高，溫度的降低和酵母菌的相互抑制作用等，細菌數目大幅減少，至第6天降到0.13×107個，之后幾乎保持穩定。這一變化趨勢與機械化黃酒發酵過程中生物胺變化趨勢相吻合，這也說明了降低黃酒中產生物胺微生物數量是控制生物胺含量的關鍵［22］。

生物胺的降低與生物胺被微生物還原利用及其他化學還原有關。微生物體內廣泛存在單胺和多胺氧化酶，該酶介導生物胺氧化生成醛，其活性受酸和氧氣的抑制［23－25］。黃酒前酵過程中間隔開耙，使其溶氧增多，抑制了該酶的作用，但后酵過程不管是在陶壇還是在大罐中，都不再開耙，隨著微生物的代謝，發酵醪中的溶氧越來越少，抑制作用減弱，這就可以解釋黃酒發酵過程中生物胺的不規則降低。另外，研究者從紹興黃酒等酒精性飲料中檢測到4-methylspinaceamine，該物質是乙醛與組胺的縮合反應產物［26］;研究還發現Lactobacillus sp.(30a和w53)含有利用組胺的操縱子［27］。

2.3 陳釀時間對黃酒中生物胺含量的影響

測定A、B、C 3個廠的部分年份酒生物胺含量(A、B廠為傳統工藝年份酒，C廠為機械化工藝年份酒)，結果見圖4。

圖4 A、B、C 3個廠家年份酒生物胺含量Fig.4 The content of biogenic amines in aging wines from three factories

從圖4中生物胺總量變化來看，傳統工藝釀制黃酒越陳，生物胺含量越低，而機械化年份酒沒有規律性變化，這說明在生物胺危害性方面，傳統工藝發酵黃酒的陳釀價值要優于機械化黃酒;以3個廠第3年的年份酒來看，機械化工藝的生物胺總量較傳統工藝低;腐胺、酪胺依舊是黃酒中的主要生物胺，不因廠家和年份而改變，3個廠的平均比例依次是:83.94%，79.04%，68.03%。但樣品并非同一批樣品，初始值本身存在差異。

3 小結與討論

本文分析了黃酒釀造過程中生物胺、氨基酸和乳酸菌的動態變化，研究表明:

(1)糯米原料和曲對黃酒生物胺影響很小，僅檢出腐胺、尸胺和精胺，但總量不超過6.01 mg/L。酒母對黃酒生物胺的影響較大，酒母中生物胺總量與總酸、酒精度呈極顯著正相關關系，與感官品質呈顯著負相關關系。

(2)黃酒釀造過程中含量最多的生物胺是腐胺，其次是酪胺;組胺的檢出率很高，但含量極少超過10.00 mg/L;色胺在傳統工藝過程中所占比例較機械化工藝高。

(3)發酵過程對黃酒生物胺的影響最大，傳統和機械化兩種工藝差異明顯，前者較后者生物胺含量高，這可能與其復雜的微生物菌落有關。長時間后酵和陳釀會降低生物胺含量，縮小兩者的差距。

(4)作為生物胺前體物質的游離氨基酸隨發酵時間含量逐漸增多，豐富的氨基酸不是限制發酵過程中生物胺形成的因素。生物胺先增多后降低且“前急后緩”的趨勢說明:產生物胺的復雜菌群隨基質條件的變化而相應變化是生物胺形成的關鍵。

基于上述結果，本文提出以下控制生物胺形成或降低生物胺含量的措施:

(1)生產上選用總酸較低、酒精度偏高、感官品評好的淋飯酒母可有效降低黃酒中生物胺含量。在實際生產的基礎上，適當延長后酵和陳釀時間也可以降低生物胺含量。

(2)由于黃酒發酵醪中乳酸菌產生物胺的能力存在差異，所以在生產上控制產生物胺能力強的菌株，或接種不產(低產)生物胺的菌株來完成發酵，是從根本上控制生物胺形成的有效方法之一。

(3)研究證明微生物體內廣泛存在單胺和多胺氧化酶，組胺和酪胺氧化酶的作用阻止了食品中的組胺和酪胺的積聚。因此，在生產上添加氧化酶或者利用特殊菌群間的相互作用可能會降低生物胺的含量。

(4)黃酒本身是一個成分復雜的不穩定膠體，不同酒樣有自己穩定的pH值和等電點，打破膠體的平衡，某些成分會析出以達到新的平衡。是否可以利用此手段來降低黃酒中生物胺含量還需要進一步研究。

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