特基拉芽孢桿菌來源β-1，3-1，4-葡聚糖酶重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化*

劉曉玲，王金晶，李永仙，朱林江，李崎

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇無錫，214122)

大麥作為一種重要的工業(yè)原料，被廣泛應(yīng)用于啤酒釀造工業(yè)及飼料工業(yè)。但其胚乳細胞壁中含有的豐富的β-1，3-1，4-葡聚糖會對其應(yīng)用造成一定的障礙，如麥芽中殘留的β-葡聚糖不但會降低麥汁的過濾速率，而且會造成成品啤酒的非生物渾濁。再者，飼料中使用大量大麥，由于動物體內(nèi)沒有可降解β-葡聚糖的酶系，使動物消化道不能降解大麥細胞壁，降低飼料的利用率，同時可能導(dǎo)致家畜腸道疾?。?］。因此，在糖化過程中或飼料中添加適量的β-1，3-1，4-葡聚糖酶將有效緩解上述問題。目前市場上所使用的β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要來源于真菌發(fā)酵生產(chǎn)，價格較昂貴。構(gòu)建高效表達的基因工程菌株生產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶成為研究熱點。山其木格等［2］將來源于地衣芽孢桿菌WS-6的β-1，3-1，4-葡聚糖酶在大腸桿菌BL21中成功表達，胞外酶活力為1 131.2 U/mL。李衛(wèi)芬等［3］利用載體pET-30a在大腸桿菌中成功表達了浸麻芽孢桿菌的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，胞外酶活力為 60.4 U/mL。謝焱［4］、李永仙等［5］在大腸桿菌中表達了來源于淀粉液化芽孢桿菌BS5582的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，培養(yǎng)基優(yōu)化后誘導(dǎo)表達酶活為1 570.83 U/mL。本實驗室選育的1株特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)，具有分泌 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的能力，經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)該酶基因與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)相似度為97.93%，與萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)相似度為94.24%，與淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BS5582相似度為92.98%，與 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和 短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)相似度分別為89.3% 和85.6%，序列上傳GenBank后所獲登錄號JX412372。為進一步研究該葡聚糖酶的性質(zhì)，將其基因在大腸桿菌中進行表達并獲得成功。本次研究采用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化培養(yǎng)基組分，以期得到更好的表達效果，為重組β-1，3-1，4-葡聚糖酶的規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET-28a(+)-bgl為本實驗室構(gòu)建，用于表達來源于特基拉芽孢桿菌B.tequilensis CGX5－1的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl，其中bgl含有該酶自身信號肽序列，表達產(chǎn)物可直接分泌至胞外。

本次研究所使用種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(tryptone 10 g/L，yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0)，初始發(fā)酵培養(yǎng)基分別為TB培養(yǎng)基(yeast extract 24 g/L，tryptone 6 g/L，甘油 4 mL，蒸餾水 900 mL，KH2PO42.31 g/L，K2HPO42.54 g/L)、SB 培養(yǎng)基(yeast extract 30 g/L，tryptone 20 g/L，葡萄糖20 g/L)和M9培養(yǎng)基(參見分子克隆指南)。誘導(dǎo)劑為IPTG和乳糖［7－8］。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

菌種活化:取甘油保藏管中融化的菌液劃線至卡納霉素(濃度50 μg/mL)抗性平板上，37℃培養(yǎng)至形成明顯單菌落。

種子培養(yǎng):挑取一單菌落接種至新鮮種子培養(yǎng)基(含終濃度50 μg/mL卡納霉素)中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，以4%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮種子培養(yǎng)基(含終濃度50 μg/mL卡納霉素)中，培養(yǎng)至OD600=1.2～1.5時，即為種子液。

搖瓶發(fā)酵:將種子液以8%接種量轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基(含終濃度50 μg/mL卡納霉素)中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=1.0，加入誘導(dǎo)劑乳糖(終濃度8 mmol/L)和IPTG(終濃度0.06 mmol/L)后，于24℃低溫誘導(dǎo)發(fā)酵。

1.2.2 酶活測定方法

發(fā)酵液8 000 r/min離心3 min后取出上清液，用蒸餾水稀釋合理倍數(shù)后，于40℃預(yù)熱。用等體積預(yù)熱至40℃的20 mmol/L pH 6.0的磷酸緩沖液稀釋的藍色大麥β-葡聚糖溶液(Megazyme公司)。取0.1 mL稀釋酶液加入0.4 mL藍色大麥β-葡聚糖底物中，于40℃反應(yīng)10 min后向每個樣品中加入3 mL沉淀液(由硫酸鋅、乙二醇甲醚、鹽酸、乙酸鈉配制而成)后立即混勻，靜置5 min后離心，測定上清液A590值，對照組為先加入沉淀液后加入藍色大麥β-葡聚糖底物的稀釋酶液。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活力的定義為:1 mL 發(fā)酵液于40℃、pH 6.0，每分鐘分解大麥β-葡聚糖產(chǎn)生1 μmol還原糖定義為1個酶活單位(U)。

1.2.3 響應(yīng)面法實驗設(shè)計

本研究以β-葡聚糖酶活為因變量(Y)，TB培養(yǎng)基各組分為變量(X)，利用Minitab16軟件進行25－1部分重復(fù)因子設(shè)計，每一獨立變量在高(+1)和低(－1)兩個水平上進行實驗，設(shè)計結(jié)果如表1所示。

表1 部分因子設(shè)計編碼值及水平

將部分因子實驗結(jié)果與中心點實驗結(jié)果進行t檢驗，根據(jù)t檢驗結(jié)果進行最速上升實驗。

根據(jù)中心組合設(shè)計進行實驗后，對結(jié)果進行二次回歸擬合，得到平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，可在一定水平范圍內(nèi)求出最佳值。二次回歸模型可表述為方程:

其中:Y為預(yù)測響應(yīng)值，即發(fā)酵液β-葡聚糖酶的酶活;b0為截距，bi，bii，bij為回歸方程的線性系數(shù)、二次項參數(shù)和交互參數(shù);xi和xj是實驗設(shè)計因子的編碼值。

通過響應(yīng)面分析可以對影響β-葡聚糖酶合成的因素及其交互作用進行評價，并能對培養(yǎng)基各組分的濃度分別進行優(yōu)化，以獲得影響過程的最佳配比。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不同會直接影響細胞增殖，從而影響到產(chǎn)物的表達效率。為了獲得較高的生物量及表達效率，本研究使用TB、LB、SB及M9四種常見培養(yǎng)基進行重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)，使用相同的誘導(dǎo)條件，結(jié)果如圖1所示。

圖1 重組大腸桿菌在不同培養(yǎng)基中的生長狀況Fig.1 Grouth curve of recombinant E.coli in different fermentation mediums

根據(jù)圖1中所得重組菌在個培養(yǎng)基中最大OD600值對照菌體干重與光密度校準曲線可知，在TB、LB、SB及M9培養(yǎng)基中最大生物量分別為6.79 g/L、1.72 g/L、2.59 g/L 及 1.28 g/L，胞外 β-葡聚糖酶活力最高值分別為1 671.9 U/mL、330.2 U/mL、375.3 U/mL及293.7 U/mL，由此可知TB培養(yǎng)基為最適發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源與氮源的選擇

為了進一步提高目的蛋白的表達量，本研究以TB培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，對其成分進行優(yōu)化。首先研究不同碳源物質(zhì)如甘油、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、小麥粉、大麥粉及玉米粉等對β-葡聚糖酶產(chǎn)量的影響。各物質(zhì)添加量均為5 g/L，由圖2可知，相同添加量下，以甘油為碳源時β-葡聚糖酶活力最高，可能是甘油作為小分子物質(zhì)更易被細胞攝取并直接利用。而葡萄糖為碳源時酶活力最低，由于葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物會對質(zhì)粒中的lac操縱子造成阻遏效應(yīng)，進而影響目的基因的表達。其他碳源物質(zhì)如玉米粉、大麥粉等雖然產(chǎn)量也較高，但需額外添加高溫淀粉酶以消化原料，故不予采用。

圖2 不同碳源對β-葡聚糖酶表達量的影響Fig.2 Effects of different carbon source on the production of β-1，3-1，4-glucanse

圖3 不同氮源對β-葡聚糖酶表達量的影響Fig.3 Effects of different nitrogen source on the production of β-1，3-1，4-glucanse

保持TB培養(yǎng)基其他成分不發(fā)生變化，分別添加相同氮原子摩爾數(shù)的5種有機氮源和4種無機氮源。結(jié)果如圖3所示，使用無機氮源時β-葡聚糖酶活力僅為有機氮源最高酶活力的10%左右，可能無機氮源僅能維持細胞生長，而不能為大量合成的目的蛋白提供原料。Tryptone為進口培養(yǎng)基，而胰蛋白胨為國產(chǎn)培養(yǎng)基，雖同為胰蛋白胨，然二者對 β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力影響明顯不同，分析后發(fā)現(xiàn)，二者的氨基酸種類并無差別，僅個別氨基酸含量差異較大，可能國產(chǎn)胰蛋白胨的純度較低，其微量雜質(zhì)反而更有利于重組菌的生長。有機氮源中效果最顯著的為Yeast extract和胰蛋白胨，Yeast extract除了含有大量氨基酸外還有核酸、維生素類等微生物生長所必須的營養(yǎng)因子，相對而言，胰蛋白胨組成成分較為單一，考慮到二者在營養(yǎng)成分上可互補，故選擇兩者作為復(fù)合氮源。復(fù)合氮源配比實驗結(jié)果表明，當二者共同為復(fù)合氮源時β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力比單一氮源時高(數(shù)據(jù)未顯示)。李永仙［9］、房淑穎［10］在對重組大腸桿菌的培養(yǎng)基進行優(yōu)化時，均使用復(fù)合氮源而非單一氮源，不但能夠提高目的蛋白產(chǎn)量而且會降低培養(yǎng)基成本。

2.3 部分因子設(shè)計及結(jié)果

表2 部分因子實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of FFD

對部分因子實驗結(jié)果進行回歸分析可知，考察的因素中 Yeast extract和 KH2PO4對 β －1，3－1，4－ 葡聚糖酶合成具有負效應(yīng)，故對這2個因素取低水平值。胰蛋白胨、甘油和 K2HPO4對 β －1，3－1，4－葡聚糖酶合成具有正效應(yīng)，故對其取高水平值。實驗結(jié)果的方差分析如表3所示，其中P值小于0.05的因素可認為其對發(fā)酵結(jié)果的影響顯著?？芍鹊鞍纂?0.001)和甘油(0.000)是顯著影響因子。

表3 部分因子實驗回歸分析結(jié)果Table 3 Regression results of FFD

由回歸分析結(jié)果可得一次擬合線性回歸方程:

實驗?zāi)Ｐ偷幕貧w方程決定系數(shù)R2=92.9%，調(diào)整決定系數(shù)=90.4%，說明模型可以很好地解釋實驗結(jié)果。

2.4 最速上升實驗

從回歸方程中胰蛋白胨和甘油的系數(shù)(X2:55.5，X3:364)可以得這兩個因素步移的步長之比為(1∶6.56)，即當胰蛋白胨步移1個單位(1 g/L)時，甘油步移6.56 mL/L。以部分因子實驗設(shè)計的中心點作為步移的起點，實驗設(shè)計與實驗結(jié)果如表4所示。從實驗結(jié)果可以看出，步移啟動時β-葡聚糖酶酶活隨著胰蛋白胨與甘油濃度的升高而增加，在步移進行至第二步時達到最高點(2 915.2 U/mL)，之后β-葡聚糖酶活開始下降。步移最高點時胰蛋白胨與甘油的濃度分別為13 g/L和10.56 mL/L，這一點被用作響應(yīng)面分析中心點

表4 最速上升實驗結(jié)果Table 4 Experimental results of steepest ascent path

2.5 中心組合設(shè)計及結(jié)果

以上研究利用部分因子設(shè)計確定了胰蛋白胨和甘油兩個顯著影響因素后，利用最速上升實驗確定了最優(yōu)的取值范圍。此部分研究利用基于中心組合設(shè)計的響應(yīng)面分析法對這兩個因素進行進一步的優(yōu)化。

中心組合實驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示，共有13個實驗點。13個實驗點可分為兩類:一類是析因點，即自變量取值在X2、X3所構(gòu)成的三維頂點，共有8個析因點;另一類是零點，為區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)5次，用以估計實驗誤差。

表5 中心組合設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of central composite design

以胰蛋白胨和甘油為自變量，β－葡聚糖酶活為響應(yīng)值，利用Minitab 16.0分析實驗數(shù)據(jù)，分析結(jié)果如表6所示，所得數(shù)學(xué)模型為:

表6 中心組合實驗回歸分析結(jié)果Table 6 Regression results of CCD

其中Y為響應(yīng)值(β-葡聚糖酶酶活)，X2為胰蛋白胨濃度，X3為甘油濃度?；貧w方程各項的方差分析表明，方程一次項與二次項的p值均小于0.05，說明胰蛋白胨與甘油的單獨影響與交互影響都較為顯著。實驗?zāi)Ｐ偷幕貧w方程決定系數(shù)R2=96.65%，調(diào)整決定系數(shù)R2

Adj=94.26%，說明模型可以很好地解釋實驗結(jié)果。

2.6 響應(yīng)面分析

對中心組合設(shè)計確定的各參數(shù)取值范圍進行響應(yīng)面分析，所得結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知在實驗取值范圍內(nèi)2圖都有最大值(響應(yīng)面的頂點或等高線的最高點)，即兩因子間的相互作用存在有利于β-葡聚糖酶酶活的最優(yōu)組合。利用Minitab 16.0軟件預(yù)測功能對兩個因素的最佳值進行尋優(yōu)，到當X2=12.5 g/L與X3=14.1 mL/L時，響應(yīng)值β-葡聚糖酶酶活有最大值，預(yù)測值為2 935 U/mL。

圖4 胰蛋白胨和甘油與β-葡聚糖酶酶活的響應(yīng)曲面及等值線Fig.4 The response surface plot and isolines for the effect of Tryptone and Glycerin on glucanase production

綜上研究結(jié)果可知，重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的最適培養(yǎng)基成分為:Yeast extract 20 g/L，胰蛋白胨12.5 g/L，甘油14.1 mL/L，KH2PO42.17 g/L，K2HPO42.74 g/L。

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果驗證

驗證實驗結(jié)果表明，初始培養(yǎng)基經(jīng)過優(yōu)化后，β-葡聚糖酶酶活(2 978.2 U/mL)與初始培養(yǎng)基(1 671.9 U/mL)相比，提高了1.78倍，與2 935 U/mL的預(yù)測值較為接近，相對誤差為0.14%，同時證明了回歸方程的可靠性和統(tǒng)計學(xué)方法的有效性。

3 結(jié)論

重組大腸桿菌產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基，與其它培養(yǎng)基相比，在TB培養(yǎng)基中生長狀況最好且酶活力最高。甘油為培養(yǎng)基的最佳碳源，其不僅為大腸桿菌的生長提供能量，而且能夠維持生長過程中細胞的形態(tài)，故而以此為碳源時發(fā)酵液上清中β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力最高。Yeast extract和胰蛋白胨為培養(yǎng)基的最適氮源，二者為大腸桿菌的生長提供豐富的氨基酸、核酸等氮源，而且酵母粉中含有維生素等微生物必不可少的生長因子，這與程至敬等［11］的研究結(jié)果相符。為了提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶的產(chǎn)量，研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化TB培養(yǎng)基組分。結(jié)果表明，胰蛋白胨和甘油為顯著影響β-1，3-1，4-葡聚糖酶產(chǎn)量的因素，通過最速上升實驗及中心組合設(shè)計，結(jié)合響應(yīng)面分析，最終得出TB培養(yǎng)基組分為:酵母粉20 g/L，胰蛋白胨12.5 g/L，甘油14.1 mL/L，KH2PO42.17 g/L，K2HPO42.74 g/L。使用優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵，上清中β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力較優(yōu)化前提高了1.78倍，說明響應(yīng)面優(yōu)化效果較為理想。本次研究通過對發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，使得重組菌發(fā)酵產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的產(chǎn)量有所上升，對日后重組酶特性的研究及其規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用等工作的展開具有積極的意義。

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