軟棗獼猴桃多糖的分離純化及抗氧化活性測定*

宣麗，劉長江，劉洋

1(沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽，110866)2(沈陽農業大學園藝學院，遼寧沈陽，110866)

軟棗獼猴桃Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch.ex Miq.又名軟棗子、獼猴梨、藤梨，是獼猴桃科、獼猴桃屬多年生落葉藤本植物［1－2］。該樹種因其葉大而密，花白色并具香味，果實外表光滑呈翠綠色，植株抗病蟲害、抗寒能力強［3－4］，已成為當前一種價值高、用途廣、極具發展前景的野生果樹。目前對軟棗獼猴桃的研究主要集中在種質資源［5－7］;花、莖、葉、根中化學成分與藥理活性的研究與應用［8－12］;果實的貯藏與保鮮［13－15］等方面。多糖是軟棗獼猴桃中主要成分之一，對其進行深入研究對于軟棗獼猴桃的開發利用有重要意義。

本實驗對微波輔助提取的軟棗獼猴桃多糖進行分離純化，并對各純化組分的抗氧化活性進行了測定，以期為軟棗獼猴桃多糖的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

軟棗獼猴桃鮮果，采自遼寧省撫順山區;DPPH，美國Sigma公司;DEAE-纖維素52，國藥集團化學試劑有限公司;Sephadex G-100、Sephadex G-200，北京索萊寶科技有限公司;其余試劑為國產分析純。

U-2910型紫外可見分光光度計，日立先端科技股份有限公司;Heto-LL 3000凍干機，賽默飛世爾科技公司;HC23B-AV型微波爐，上海新儀微波化學科技有限公司;5805型高速冷凍離心機，德國艾本德公司;RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;HL-2B數顯恒流泵、BS-100A自動部份收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 軟棗獼猴桃多糖粗品的制備

軟棗獼猴桃鮮果破碎后采用確定的乙醇除雜工藝:乙醇體積分數80%、料液比1∶2(g∶mL)、時間60 min，去除軟棗獼猴桃果中大量的色素類雜質及還原糖，抽濾，棄去上清液，沉淀部分采用微波輔助提取工藝:料液比 1∶9(g∶mL)、微波處理時間 10 min、微波功率500 W進行提取，提取結束后，離心獲得的上清液進行減壓濃縮，然后用4倍體積的無水乙醇沉淀，4℃冷藏過夜，沉淀離心后依次用石油醚、丙酮、無水乙醇浸泡洗滌，抽濾后冷凍干燥，得微波輔助提取的軟棗獼猴桃多糖粗品。

1.3 軟棗獼猴桃多糖純品的制備

1.3.1 DEAE-纖維素陰離子交換層析分離［16］

將軟棗獼猴桃多糖粗品復溶(5 mg/mL)，其水溶液經DEAE-纖維素柱層析(d 1.6 cm×30 cm)，每次上樣10 mL，依次用蒸餾水、0～1 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，洗脫速度為1.25 mL/min，每管5 mL分部收集，逐管檢測多糖含量(苯酚-硫酸法A490)、蛋白質含量(紫外A280)、核酸含量(紫外A260)，分別收集單一峰組分，透析脫鹽濃縮后，備用。

1.3.2 SephadexG-100凝聚柱層析純化

將DEAE-cellulose-52層析柱分離得到的軟棗獼猴桃多糖組分經SephadexG-100(φ1.0 cm×40 cm)凝膠柱進行純化。凝膠層析柱先用0.1 mol/L NaCl溶液平衡48 h，再以0.1 mol/L NaCl溶液進行洗脫，每次上樣5 mL，流速為0.5 mL/min，每管5 mL分部收集，逐管檢測多糖含量(苯酚-硫酸法A490)和蛋白質含量(紫外A280)，分別收集單一峰組分，透析脫鹽濃縮后，備用。

1.3.3 SephadexG-200凝聚柱層析純化

將SephadexG-100層析柱純化得到的軟棗獼猴桃多糖組分經SephadexG-200(φ1.0 cm×40 cm)凝膠柱進一步純化。凝膠層析柱先用0.1mol/L NaCl溶液平衡48h，再以0.1mol/L NaCl溶液進行洗脫，每次上樣4 mL，流速為0.25 mL/min，每管4 mL分部收集，逐管檢測多糖含量(苯酚-硫酸法A490)和蛋白質含量(紫外A280)，分別收集單一峰組分，透析脫鹽濃縮后，冷凍干燥，得軟棗獼猴桃多糖純品，稱量后備用。

1.4 軟棗獼猴桃多糖純品的抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

［17］，分別配制濃度為 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的軟棗獼猴桃多糖純品溶液1 mL，分別加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液3 mL，混勻后置暗處，室溫反應30 min后，以蒸餾水調零點，在517 nm處測定空白管的吸光值AC、樣品管的吸光值AS，Vc為陽性對照。半抑制濃度IC50，根據濃度-清除率二維曲線上讀取的清除率為50%時對應的濃度值計算［18］，按下列公式計算DPPH自由基的清除率。

式中:AC為空白管的吸光值;AS為樣品管的吸光值。

1.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

參考文獻［19］分別配制濃度為 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的軟棗獼猴桃多糖純品溶液1 mL，分別加入10 mmol/L的FeSO41 mL，10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加入8.8 mmol/L的H2O21 mL啟動反應，37℃反應30 min，在510nm下測定空白管的吸光值AC、樣品管的吸光值AS，Vc為陽性對照。半抑制濃度IC50，根據濃度-清除率二維曲線上讀取的清除率為50%時對應的濃度值計算［16］，按下列公式計算羥基自由基的清除率。

式中:AC為空白管的吸光值;AS為樣品管的吸光值。

1.4.3 超氧陰離子自由基(O－2·)清除能力的測定

參考文獻［19］分別配制濃度為 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的軟棗獼猴桃多糖純品溶液1 mL，分別加入4.5 mL 50 mmol/L pH=8.2的Tris-HC1緩沖液，混勻，于25℃恒溫水浴中保溫20 min，取出后立即加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速搖勻后于25℃恒溫水浴中反應5 min，加入8 mmol/L HCl 1 mL，終止反應，于320 nm處測定空白管的吸光值AC、樣品管的吸光值AS，Vc為陽性對照，按下列公式計算超氧陰離子自由基的清除率。

式中:AC為空白管的吸光值;AS為樣品管的吸光值。

2 結果與分析

2.1 軟棗獼猴桃多糖的DEAE-cellulose-52陰離子交換層析結果

由圖1可知，軟棗獼猴桃多糖經DEAE-纖維素-52柱分離時，依次用水、0.1 NaCl、0.2、0.3 mol/L NaCl洗脫出4個組分，逐管檢測多糖、蛋白質和核酸含量，結果表明，0.1 mol/L NaCl鹽洗組分中含有少量的蛋白質和核酸，其余組分中均未檢出。

圖1 軟棗獼猴桃多糖的DEAE-cellulose-52柱層析洗脫曲線Fig.1 DEAE-cellulose-52 anion-exchange column chromatogram of Actinidia arguta polysaccharide

2.2 SephadexG-100凝聚柱層析結果

由圖2可知，經過陰離子交換柱層析得到的各多糖組分再經過SephadexG-100凝聚柱層析后，都是只得到一個洗脫峰且峰形比較對稱。逐管檢測蛋白質含量，結果表明每個組分中均含有極微量的蛋白。

圖2 軟棗獼猴桃多糖各組分SephadexG-100凝聚柱層析洗脫曲線Fig.2 SephadexG-100 column chromatogram of pure fractions after anion-exchange column separation

2.3 SephadexG-200凝聚柱層析結果

由圖3可知，經過Sephadex G-100凝聚層析柱純化后的各多糖組分再經過Sephadex G-200凝聚柱層析，依然只得到一個洗脫峰且峰形對稱，說明經離子交換柱分離得到的每一部分為具有相同分子質量的同一組分，在凝膠柱上不再分離。逐管檢測蛋白質含量，結果表明每個組分中都不含有蛋白質。收集各組分，以去離子水透析(截留MW14 kDa)，濃縮后冷凍干燥。經計算，水洗組分、0.1鹽洗組分、0.2鹽洗組分和0.3鹽洗組分分別占總洗脫量的14.7%、50.2%、26.1%和9.0%，總回收率為82.4%。0.1鹽洗組分為主要洗脫組分。

圖3 軟棗獼猴桃多糖各組分SephadexG-200凝聚柱層析洗脫曲線Fig.3 SephadexG-200 column chromatogram of pure fractions after SephadexG-100 column separation

2.4 軟棗獼猴桃多糖各純化組分抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

由圖4可知，隨著樣品濃度的增加，軟棗獼猴桃多糖各純化組分清除DPPH自由基的能力也逐漸增強，表現出明顯的量-效關系。4個組分對DPPH自由基的清除能力為:0.1鹽洗組分＞0.3鹽洗組分＞0.2鹽洗組分＞水洗組分，其中水洗組分的清除能力最弱，當該組分濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率僅為9.6%。

圖4 軟棗獼猴桃多糖各純化組分對DPPH自由基的清除率Fig.4 DPPH·-scavenging rate of pure fractions from Actinidia arguta polysaccharide

2.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

由圖5可知，軟棗獼猴桃多糖水洗組分沒有清除羥基自由基的能力，3個鹽洗組分隨著樣品濃度的升高，對羥基自由基的清除能力逐漸增強，也表現出明顯的量-效關系。3個鹽洗組分對羥基自由基的清除能力為:0.1鹽洗組分＞0.3鹽洗組分＞0.2鹽洗組分。

圖5 軟棗獼猴桃多糖各純化組分對羥基自由基的清除率Fig.5 OH scavenging rate of pure fractions from Actinidia arguta polysaccharide

由圖6可知，軟棗獼猴桃多糖各純化組分對超氧陰離子自由基的清除能力很弱。4個組分中0.3鹽洗組分的清除能力最強，但當該組分濃度為2.5 mg/mL時，對超氧陰離子自由基的清除率只有20.3%。

圖6 軟棗獼猴桃多糖各純化組分對超氧陰離子自由基的清除率 mg/mLFig.6 scavenging rate of pure fractions from Actinidia arguta polysaccharide

3個鹽洗組分和陽性對照Vc清除DPPH自由基和羥基自由基的IC50見表1。

表1 軟棗獼猴桃多糖3個鹽洗組分與Vc抗氧化活性的比較Table 1 Comparison of antioxidant activity of three brine elution fractions and Vc

由表1可知，3個鹽洗組分的抗氧化活性為:0.1鹽洗組分＞0.3鹽洗組分＞0.2鹽洗組分，但與Vc相比，還有一定的差距。

3 結論

(1)微波輔助提取的軟棗獼猴桃多糖經DEAE-纖維素層析分離得到4個組分:水洗組分、0.1鹽洗組分、0.2鹽洗組分和0.3鹽洗組分，這4個組分經SephadexG-100、SephadexG-200凝聚柱層析進一步純化，都是只得到一個洗脫峰且峰形對稱，表明這4個組分都為均一多糖，經檢測每個組分中都不含蛋白質。水洗組分、0.1鹽洗組分、0.2鹽洗組分和0.3鹽洗組分分別占總洗脫量的14.7%、50.2%、26.1%和9.0%，總回收率為82.4%。0.1鹽洗組分為主要洗脫組分。

(2)各純化組分的抗氧化活性測定結果表明:軟棗獼猴桃多糖具有一定清除DPPH自由基和羥基自由基的能力，對超氧陰離子自由基的清除能力很弱;鹽洗組分的抗氧化活性明顯優于水洗組分;3個鹽洗組分中0.1鹽洗組分的抗氧化活性最強，0.3鹽洗組分次之，0.2鹽洗組分最弱;0.1鹽洗組分為軟棗獼猴桃多糖中主要的抗氧化活性組分。

參考文獻

［1］ Kim J G，Takami Y，Mizugami T，et al.CPPU application on size and quality of hardy kiwifruit［J］.Scientia Horticulturae，2006，110:219－222.

［2］ 張嵐芝，張先，周美英等.3種長白山野生獼猴桃營養及功能成分比較［J］.延邊大學農學學報，2010，32(2):106－109.

［3］ 孫寧寧.長白山野生軟棗獼猴桃的成分分析及保鮮研究［D］.吉林:吉林農業大學，2007.

［4］ 樸一龍，趙蘭花.軟棗獼猴桃研究進展［J］.北方園藝，2008(3):76－78.

［5］ Kataoka I，Mizugami T，Kim J G，et al.Ploidy variation of hardy kiwifruit(Actinidia arguta)resources and geographic distribution in Japan［J］.Scientia Horticulturae，2010，124:409－414.

［6］ Korkovelos A E，Mavromatis A G，Huang W G，et al.Effectiveness of SSR molecular markers in evaluating the phylogenetic relationships among eight Actinidia species［J］.Scientia Horticulturae，2008，116:305－310.

［7］ 樸一龍，趙蘭花.延邊地區軟棗獼猴桃資源分布和開發利用前景［J］.延邊大學農學學報，2009，31(1):32－34.

［8］ Matich A J，Young H，Allen J M，et al.Actinidia arguta:volatile compounds in fruit and flowers［J］.Phytochemistry，2003，63:285－301.

［9］ 徐一新，項昭保，陳海生.獼猴桃屬植物化學成分和生物活性研究進展［J］.解放軍藥學學報，2011，27(2):164－169.

［10］ 金永日，桂明玉，馬冰如，等.軟棗獼猴桃根化學成分的研究［J］.中國藥學雜志，1998，33(7):402－404.

［11］ 蒼晶，王學東，徐仲等.獼猴桃營養器官化學成分［J］.北方園藝(總128):51.

［12］ 張強，李曼玲，康琛，等.中藥藤梨根研究概況［J］.中國中醫藥信息雜志，2008，15(11):101－102.

［13］ Anne W H，Nihalde S，Cecilia R T，et al.Evaluation of softening characteristics of fruit from 14 species of Actinidia［J］.Postharvest Biology and Technology，2005，35:143－151.

［14］ 王博，樸一龍，王琳，等.野生軟棗獼猴桃果實生長發育過程中生理生化變化［J］.延邊大學農學學報，2011，33(1):6 －9.

［15］ 屈慧鴿，孫憲忠，趙淑蘭，等.軟棗獼猴桃貯藏過程中軟化因素研究［J］.特產研究，1999(3):25－28.

［16］ 孫元琳.當歸多糖的制備、結構分析和抗輻射效應研究［D］.無錫:江南大學，2006.

［17］ 張立華，張元湖，安春艷，等.石榴皮提取物的大孔樹脂純化及其抗氧化性能［J］.農業工程學報，2009，25:142－146.

［18］ 馬惠玲，盛義保，張麗萍，等.蘋果渣果膠多糖的分離純化與抗氧化活性研究［J］.農業工程學報，2008，24:218－222.

［19］ 王菲.軟棗獼猴桃黃酮類化合物的提取純化及生物活性研究［D］.沈陽:沈陽農業大學，2011.