規(guī)模化制備藻藍蛋白工藝技術(shù)研究進展*

邵明飛，趙楠，劉冰，秦松

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點實驗室，江蘇南京，210095)2(曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東曲阜，273165)3(中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所生物資源實驗室，山東煙臺，264003)

藻藍蛋白作為天線捕光色素蛋白，是由一個輔基蛋白與藻藍膽素(開鏈線性四吡咯)共價結(jié)合而成，其基本構(gòu)架是由α亞基與β亞基形成單聚體(αβ)，然后單聚體間通過連接多肽形成三聚體(αβ)3或者六聚體(αβ)6。α亞基84位處的半胱氨酸與β亞基84位處、155位處的半胱氨酸各通過硫醚鍵共價連接藻藍膽素［1－2］。

藻藍蛋白是一種天然藍色色素，已作為食物色素添加在軟飲料，口香糖，唇膏，眼線等產(chǎn)品中。高純度的藻藍蛋白因其具有高效的熒光性，被作為生物化學(xué)探針應(yīng)用在免疫分析研究［3－4］。藻藍蛋白具有抗氧化、增強機體免疫力、保肝護肝、抗癌、抗炎等諸多生理活性，具有重大的潛在藥用開發(fā)價值［1，5－9］。藻藍蛋白主要從螺旋藻、魚腥藻等藻類中提取純化得來，不同純度(A620/A280)的藻藍蛋白有不同的用途。A620/A280大于等于0.7時，藻藍蛋白為食品級;A620/A280大于等于3.9時，藻藍蛋白為反應(yīng)級;A620/A280大于等于4.0時，藻藍蛋白為分析級［10］。藻藍蛋白具有十分廣闊的應(yīng)用前景，但繁瑣的純化步驟不僅制約著它的大規(guī)模生產(chǎn)也導(dǎo)致其價格昂貴。食品級藻藍蛋白的價格約為0.13美元/mg，分析級的藻藍蛋白價格為1 ～5 美元/mg［11］。

藻藍蛋白純化過程的費用約占其成本的50%～90%［12］。藻藍蛋白傳統(tǒng)純化方法包括:(1)破碎細(xì)胞，制備藻藍蛋白粗提液;(2)應(yīng)用傳統(tǒng)的分離技術(shù)純化藻藍蛋白，如離心、硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾層析、羥基磷灰石層析等。這些方法耗時、復(fù)雜，難以大規(guī)模制備藻藍蛋白［13］。近幾年新技術(shù)如雙水相萃取技術(shù)、反膠團萃取技術(shù)、膜分離技術(shù)、擴張床吸附層析等的不斷發(fā)展給藻藍蛋白規(guī)模化制備工藝的提升提供了新機遇。本文對這些新技術(shù)在藻藍蛋白規(guī)模化制備上的應(yīng)用研究進行了綜述。

1 雙水相萃取技術(shù)

大部分萃取采用的一個是水相，另一個是有機相。但有機相溶液易使蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)變性。一些高分子水溶液(如分子質(zhì)量從幾千到幾萬的聚乙二醇與磷酸鹽組合成的水溶液)可以分為2個水相，生物質(zhì)在2個水相中的溶解度有很大的差別，進而選擇性分配［14］，故可以利用雙水相體系萃取分離蛋白質(zhì)等水溶性的生物產(chǎn)品。很多實例報道表明雙水相體系已成功應(yīng)用于大規(guī)模處理富集分離生物物質(zhì)［15］。

Patil等［12，16］設(shè)計了一個簡單而高效的技術(shù)流程，該流程包括2個步驟:雙水相萃取和離子交換吸附層析，其研究結(jié)果:從螺旋藻中得到的藻藍蛋白粗提物，其純度為1.18，經(jīng)過雙水相萃取后，純度提高為5.22，繼續(xù)經(jīng)離子交換吸附層析柱純化 ，純度從5.22上升為6.69。操作流程具體如下:(1)用蒸餾水清洗新鮮螺旋藻2～3次，洗滌干凈的螺旋藻經(jīng)壓力為200～400 kg/cm2的高壓細(xì)胞勻漿機破碎5～6 min。將破碎的螺旋藻懸濁液于離心機中離心 10 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，得到的藻藍蛋白粗提液于4～5℃下儲存;(2)向藻藍蛋白粗提液中加入總體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.28%的聚乙二醇和11.63%的磷酸鉀鹽，徹底攪拌1h，靜置過夜使兩相分開，分別移取上下相的溶液，在波長280，620，650 nm處測上下相溶液的吸光度，計算各相藻藍蛋白的質(zhì)量濃度和純度;(3)經(jīng)上述步驟富集分離得到的藻藍蛋白液過DEAE-Sephadex陰離子交換層析柱，采用0～0.35 mol/L的NaCl進行線性洗脫，收集NaCl濃度為0.25～0.3 mol/L時的洗脫液，透析凍干成粉。劉楊等［17］以PEG/硫酸鈉雙水相體系，從鈍頂螺旋藻細(xì)胞破碎液中富集分離藻藍蛋白。其研究結(jié)果表明，萃取最適條件為 1%KCl，15%Na2SO4，12%PEG4000，分離因素達到6.33，分配系數(shù)達到8.01，藻藍蛋白回收率為91.2%。

雙水相萃取技術(shù)在富集分離生物活性物質(zhì)上具有以下優(yōu)勢:(1)兩相含水量均高達70% ～90%，適于提取水溶性的蛋白質(zhì)、酶等生物活性物質(zhì)，且不易引起蛋白質(zhì)的變性失活;(2)不存在有機溶劑殘留問題;(3)易于放大和連續(xù)操作，各種參數(shù)可按比例放大而產(chǎn)物收率并不降低［18］。

2 反膠團萃取技術(shù)

反膠團是指非極性溶劑中表面活性劑分子濃度超過臨界膠束濃度引發(fā)形成的表面活性劑的極性頭朝內(nèi)、非極性頭朝外的具有極性內(nèi)核的多分子聚集體［19］。反膠團的極性內(nèi)核可溶解少量水而形成微型水池，可溶解蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等生物物質(zhì)。微型水池周圍包裹的一層水膜以及表面活性劑極性頭的保護可避免生物物質(zhì)與有機溶劑直接接觸而失活。通過調(diào)節(jié)水相pH值及鹽離子濃度等因素使生物物質(zhì)反萃取到水相中，實現(xiàn)生物物質(zhì)的溶解和分離［20］。

劉楊等［21］采用 CTAB/正戊醇-正辛烷反膠團溶液萃取分離藻藍蛋白，并研究了有機相中助劑濃度、表面活性劑濃度與水相中離子種類、強度等因素對萃取效果的影響。研究結(jié)果表明，采用0.04 mol/L CTAB/正戊醇-正辛烷(體積比1∶4)的反膠團溶液萃取pH 7.0的螺旋藻細(xì)胞破碎液(包含0.1 mol/L KCl)，分配系數(shù)達26.0，藻藍蛋白萃取率達96.3%;采用pH 5.0的反萃取液(包含2 mol/L KBr)反萃取藻藍蛋白，反萃取率達90.6%。具體操作步驟:(1)稱取0.5 g螺旋藻粉，加入100 mL pH 7.0 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌均勻后反復(fù)凍融3次。將破碎的螺旋藻細(xì)胞懸濁液經(jīng)離心機離心20 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，獲得藻藍蛋白粗提液;(2)將CTAB以體積比為1∶4的比例溶于正辛烷和正戊醇的混合液中，并用磷酸鹽緩沖液洗滌2～3次 ，得到透明澄清的CTAB反膠團溶液;(3)反膠團溶液和藻藍蛋白粗提液等體積加入到10 mL具塞離心管 ，以60次/min的頻率，恒溫25℃上下顛倒離心管10 min，靜置分層，移取水相;(4)向離心管中加入與上相等體積的pH 7.0 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.1 mol/L KCl)溶液 ，恒溫25℃，以60次/min的頻率上下顛倒離心管2 h，靜置分層，移取水相，水相即為反膠團反萃取液。

反膠團萃取技術(shù)在富集分離生物活性物質(zhì)上具有以下優(yōu)勢:(1)選擇性好、分離效率高;(2)分離速度快，具有提純和濃縮作用;(3)分離條件溫和，保持生物物質(zhì)高活性;(4)正萃和反萃同時進行，分離料液處理簡單，易放大，操作方便。

3 膜分離技術(shù)

膜分離技術(shù)被認(rèn)為是對傳統(tǒng)化學(xué)分離方法的一次革命，其利用天然或人工合成的、具有選擇透過性的薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動力，實現(xiàn)對雙組分或多組分的溶質(zhì)和溶劑選擇性分離的技術(shù)［22］。純化分離所采用的膜主要是超/微濾膜，由于其所能截留的物質(zhì)粒徑大小分布范圍廣，被廣泛應(yīng)用于固液分離、大小分子物質(zhì)的分離、脫除色素、產(chǎn)品提純、油水分離等工藝過程中。

Jaouen等［23］用膜分離技術(shù)對螺旋藻的藻藍蛋白提取液進行純化和濃縮。具體操作流程為:(1)Zarrouk培養(yǎng)基培養(yǎng)的螺旋藻收獲后用滅過菌的去離子水清洗，藻體懸濁液在－35℃進行凍融，最后用超聲波處理;(2)采用有機管膜的納濾膜MT03，其截通分子質(zhì)量為500Da，膜面積為0.05 m2/module，控制進料壓力為30×105Pa，切線流速為1.5 m/s，對上述樣品進行處理，得到藻藍蛋白的回收率為100%，濃縮因子達到7。Chaiklahan等［24］采用超微濾膜的方法處理藻藍蛋白粗提液，得到了食品級藻藍蛋白，其操作流程為:(1)新鮮的螺旋藻按照1∶100的比例加入磷酸鹽緩沖液，用漿輪不斷攪拌4h，轉(zhuǎn)速為300 r/min;(2)懸濁液離心15 min，離心力為4 800×g，去除細(xì)胞碎片，得到藻藍蛋白粗提液;(3)采用膜孔徑為5um的濾膜，按照流速為150 mL/min，滲透通量為58.5L/(h·m2)的處理條件對藻藍蛋白粗提液進行粗過濾，藻藍蛋白的回收率為88.6%;以膜孔徑為0.8/0.2um的濾膜，采用流速為100 mL/min，滲透通量為336L/(h·m2)的處理條件對粗過濾得到的濾液進行精過濾，藻藍蛋白的回收率為82.9%;(4)采用截通分子質(zhì)量為50 kDa，平均滲透量為26.8L/(h·m2)的濾膜，按照壓強為69kPa，流速為75 mL/min的處理條件對精過濾得到的濾液進行超濾。經(jīng)過這幾步處理，藻藍蛋白的純度達到1.0左右，即達到食品級要求。

超/微濾膜過濾與傳統(tǒng)過濾的不同在于不同分子質(zhì)量的化合物可通過膜進行有效分離，這個過程是一種物理過程，不發(fā)生相的變化，不需要添加助劑。采用膜進行分離純化的優(yōu)點［25－26］:(1)分離效果好，過濾分離回收率高，產(chǎn)品質(zhì)量高，運行成本低;(2)過程無需添加化學(xué)藥品、溶媒溶劑，不帶入二次污染物質(zhì);(3)設(shè)備可自動運行，穩(wěn)定性好，容易實現(xiàn)工業(yè)化擴產(chǎn)需求。

4 擴張床吸附技術(shù)

擴張床吸附(expanded bed absorption，EBA)技術(shù)是20世紀(jì)90年代開發(fā)的一種新型生化分離技術(shù)［27］，最大特點是可以從含有固體生物質(zhì)顆粒(如細(xì)胞、細(xì)胞碎片)的料液中直接捕獲目標(biāo)物，集固液分離、濃縮和初期純化于一個單元操作之中，可以縮短分離步驟，減少活性物質(zhì)損失，提高產(chǎn)品收率，節(jié)省分離成本，而且獲得的高濃度、高純度的粗提液可直接用于下一步的純化操作，體現(xiàn)了生物分離過程的集成化優(yōu)勢［28］。

Ramos等［29］采用擴張床吸附技術(shù)大規(guī)模純化水生集胞藻藻藍蛋白，技術(shù)流程如下:通過滲透沖擊法(pH 7.0、50 mmol/L磷酸鈉緩沖液，浸提3次)破碎水生集胞藻細(xì)胞壁，離心獲得上清液(A615/A280為0.7)，流經(jīng) EBAC(吸附劑為 Streamline-DEAE，柱內(nèi)徑15 mm;最優(yōu)參數(shù)為:吸附量4.9 mg/mL吸附劑，擴張床體積為固定床的2倍，進樣液黏度1.020 mPa，pH 7.0、500 mmol/L 磷酸鈉緩沖液洗脫)，此步驟藻藍蛋白回收率為91%;富含藻藍蛋白的洗脫液(A615/A280為2.61)經(jīng)透析后再經(jīng)DEAE陰離子交換層析柱純化(吸附劑為DE-52，柱2.5 cm×20 cm，pH 7.0、290 mmol/L磷酸鈉緩沖液洗脫，流速50 mL/h)進行純化，此純化步驟藻藍蛋白回收率為76%，A615/A280大于4.0;最終藻藍蛋白回收率為69%，向富含藻藍蛋白的洗脫液添加硫酸銨至飽和度為70%，4℃靜置12 h，離心，沉淀復(fù)溶于5 mmol/L磷酸鈉緩沖液中，4℃透析過夜，真空冷凍干燥成粉。Bermejo R等［30］采用1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)浸泡螺旋藻，然后離心獲得藻藍蛋白粗提液，經(jīng)透析后進而經(jīng)裝填有陰離子交換樹脂Streamline-DEAE的擴張床吸附柱純化，洗脫收集藻藍蛋白純度(A620/A280)大于2.0的洗脫液，回收率為80%;收集到的富含藻藍蛋白洗脫液透析后再經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾層析色譜純化，收集藻藍蛋白洗脫液;向藻藍蛋白洗脫液中添加硫酸銨至飽和度為70%，離心后收集沉淀，沉淀復(fù)溶后透析，經(jīng)DEAE-52離子交換層析柱純化，藻藍蛋白洗脫液經(jīng)透析后，冷凍干燥成粉，最終藻藍蛋白的得率為9.6%。Niu等［13］采用擴張床吸附技術(shù)從劣質(zhì)的螺旋藻粉中制備藻藍蛋白，其工藝流程為:采用0.5mol/L濃度的硫酸銨浸泡螺旋藻粉，經(jīng)離心獲得藻藍蛋白粗提液;藻藍蛋白粗提液經(jīng)填充Phenyl-sepharose柱料的擴張床色譜純化后，洗脫液中藻藍蛋白純度(A620/A280)達2.87;純度(A620/A280)為2.87的藻藍蛋白溶液透析后再經(jīng)Q-sepharose離子交換層析柱純化，收集藻藍蛋白純度(A620/A280)大于3.2的洗脫液，其余部分洗脫液透析后經(jīng)羥基磷灰石柱層析純化，收集純度(A620/A280)大于3.2的藻藍蛋白洗脫液;最終匯總純度(A620/A280)大于3.2的藻藍蛋白溶液，經(jīng)透析后冷凍干燥成干粉，回收率為13.7%。Ramos等［31］利用擴張床吸附色譜技術(shù)提取魚腥藻凍干粉中的藻藍蛋白，其流程為:按照1∶20的料液比獲得藻粉懸浮體系，常溫磁力攪拌，離心，獲得藻藍蛋白粗提液;藻藍蛋白粗提液經(jīng)Streamline-DEAE擴張床吸附色譜柱純化后，收集富含藻藍蛋白的洗脫液;藻藍蛋白洗脫液經(jīng)硫酸銨沉淀、復(fù)溶、透析，再經(jīng)DEAE-52陰離子交換層析色譜柱純化，收集富含藻藍蛋白洗脫液;向藻藍蛋白洗脫液中添加硫酸銨至飽和度為70%，4℃黑暗條件靜置過夜，離心，沉淀復(fù)溶于磷酸鹽緩沖液，再經(jīng)透析得到藻藍蛋白溶液，最終藻藍蛋白回收率為62%，溶液冷凍干燥為藻藍蛋白粉。

5 展望

藻藍蛋白作為熒光探針可用于細(xì)胞及大分子標(biāo)記，作為天然色素可用于食品及化妝品行業(yè)，其具有抗氧化、抗癌活性，可作為治療藥物用于醫(yī)藥領(lǐng)域。雖然藻藍蛋白有諸多用途，但高昂的純化制備費用限制了藻藍蛋白的廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的藻藍蛋白純化流程包括很多單元操作，如沉淀、離心、透析、離子交換色譜層析、凝膠過濾色譜層析、羥基磷灰石色譜層析等。一般來說，傳統(tǒng)的藻藍蛋白制備方法主要包括2個過程:(1)樣品的預(yù)處理，釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，獲得粗提液;(2)應(yīng)用傳統(tǒng)色譜技術(shù)純化藻藍蛋白。樣品前處理主要目的是破碎細(xì)胞，方法有超聲波破碎、酶解、凍融、機械破碎、利凡諾處理、吐溫X-100處理、丙酮處理等。其中，凍融、滲透沖擊、超聲波破碎是實驗室常用的細(xì)胞破壁方法。高壓細(xì)胞破碎技術(shù)及珠磨破碎技術(shù)破壁效率高，在工業(yè)上應(yīng)用較多。細(xì)胞破壁后，經(jīng)固液分離獲得粗提液。第二步涉及到多種色譜層析的綜合利用，包括疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾層析。這些傳統(tǒng)方法的一大弊端在于步驟繁瑣，目的產(chǎn)物損失較大，成本較高，耗時長，很難規(guī)模化操作。提高細(xì)胞破壁效果，減少純化步驟，提高產(chǎn)品的純度和收率是藻藍蛋白規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵。本文綜述了近幾年發(fā)展較快的幾種高效、經(jīng)濟、適合規(guī)模化制備的生物分離方法，并結(jié)合本實驗室的工作，現(xiàn)提出一種規(guī)模化制備藻藍蛋白的方案(圖1)。該方案采用高壓細(xì)胞破碎技術(shù)處理樣品，處理后的溶液流經(jīng)擴張床吸附層析柱，洗脫得到藻藍蛋白富集液;然后用藻藍蛋白富集液與PEG、鹽配制雙水相體系，吸取藻藍蛋白所在液相液體后經(jīng)超濾處理，得到的溶液凍干成藻藍蛋白粉。

圖1 規(guī)模化制備藻藍蛋白的方案Fig.1 Scheme of the production of phycocyanin in large scale

我國螺旋藻干粉年產(chǎn)量近萬噸，超過全球總產(chǎn)量的50%，這為藻藍蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)提供了原料支持。目前我國螺旋藻產(chǎn)業(yè)以銷售螺旋藻原粉、膠囊、片劑為主，產(chǎn)品深加工程度低。以螺旋藻為原料，提取制備藻藍蛋白以及其他活性成分，增加產(chǎn)品附加值，豐富產(chǎn)品種類，促使產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型升級是擺在政府工作者、企業(yè)家以及科研工作者面前的具有重大創(chuàng)新意義及經(jīng)濟價值的課題。

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