堅強腸球菌SQ-3-2基于Lux S群體感應系統信號分子AI-2的檢測及方法優化*

張騰，賀銀鳳

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特，010018)

群體感應(quorum sensing，簡稱QS)即細菌隨著菌體密度的增大和生長周期的變化分泌出一種或幾種化學信號分子，通過這些信號分子進行種內或種間交流，協調群體行為［1］。QS現象已經被證實可以調控很多細菌生理生化功能的變化，如生物發光、生物膜形成、細菌毒性、芽孢形成、結合感受態形成、生物群游速率和細菌素的產生等［2］。近幾年的研究表明，二類信號分子(Autoinducer-2，簡稱AI-2)在微生物細胞間交流中起到關鍵作用，廣泛存在于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中［3］。

1993 年，Bassler［4］等最初在哈維氏弧菌(Vibro harveyi)中發現AI-2作為信號分子調控V.harveyi的生物發光現象，這是AI-2首次被人們所知。目前已知大約70多個種屬的細菌基因組中都含有luxS的同源序列［3］，并且AI-2的生物合成途徑基本都是相似的［5］。AI-2的生物合成與細菌一碳單位的代謝有關，即 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的代謝途徑之一。SAM將甲基轉移到底物之后生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH對SAM依賴的甲基轉移酶有很強的抑制作用，即SAH對細胞有毒害作用。故SAH在生成之后迅速被S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶降解為S-核糖高半胱氨酸(SRH)和腺嘌呤。隨后LuxS催化SRH生成同型半胱氨酸和4，5-二羥基-2，3-戊二酮(4，5-dihydroxy-2，3-pentanedione，簡稱 DPD)，DPD 是合成AI-2的前體物質［5］，其易溶于水自發環化形成幾種呋喃糖，排出胞外成為AI-2信號分子。在高細胞密度的情況下，信號分子擴散進入細胞，當信號分子在細胞內達到一個特定的濃度閾值后，與胞內的信號分子接收器 LuxR蛋白結合，并與啟動子區和RNA聚合酶相互作用，啟動基因表達，激活熒光操縱子的轉錄和生物熒光的產生［6］。

大量研究表明，Lux S介導的群體感應系統對腸球菌屬微生物的耐藥性及多種生理現象有重要的調控作用［11］，且Lux S介導的群體感應系統可能在乳桿菌屬微生物中調控二類細菌素的產生［8］。本課題組之前的研究發現堅強腸球菌SQ-3-2可以高產抑菌物質，抑制枯草芽孢桿菌和假單胞李斯特氏菌的生長［9］。故在前人研究的基礎上，我們首次進行了Lux S介導的群體感應系統對堅強腸球菌SQ-3-2產生細菌素及其生理功能的影響的研究。堅強腸球菌SQ-3-2是否存在Lux S介導的群體感應系統以及是否產生具有活性的AI-2信號分子還尚未見報道，且其培養過程中產生的大量有機酸和細菌素較大程度的影響了檢測過程，故本研究著力探討了堅強腸球菌SQ-3-2的AI-2信號分子的產生和檢測，并對檢測方法進行了優化，為檢測乳酸菌中的AI-2信號分子奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

實驗菌株堅強腸球菌SQ-3-2分離自內蒙古錫盟地區酸馬奶酒中，由內蒙古農業大學“酸馬奶酒中抗菌因子的研究”課題組提供。

哈維氏弧菌BB170購自ATCC。哈維氏弧菌BB170系哈維氏弧菌BB120的定向突變菌株，其AI-1信號分子的感受器是缺失的，故僅對AI-2信號分子發生反應并發光。此外其產生AI-2信號分子的lux S基因是完整的，在菌體密度達到一定程度時，可以自行產生AI-2。哈維氏弧菌BB170是目前國際上通用的便捷有效的檢測AI-2信號分子的指示菌株［10］。

1.1.2 培養基

MRS培養基購自廣東環凱微生物有限公司;2216海生菌液體培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司;AB培養基依照文獻［10］配制。

1.1.3 主要儀器設備

Perkin Elmer多功能酶標儀;Thermo 96孔板酶標儀(檢測范圍0～6 abs，線性范圍0～4 abs，準確度±0.001);精達HZQ-C氣浴恒溫振蕩器;智凈SW-CJ-1FD超凈工作臺;HIRAYAMA高壓鍋;SK-1快速混勻器;LG10-24A離心機;Sartorivts PB-10pH儀，96孔酶標板購自Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌發酵上清液的制備

30℃條件下，將在MRS培養基中活化2代且培養至對數期的堅強腸球菌SQ-3-2按照1∶100的接種比例接種至新鮮MRS培養基中，繼續培養至6、8、10、12、14、16、18、20、22 和 24 h，使用 Thermo 96 孔板酶標儀測定各時間點的OD630nm吸光度值。分別取上述10個時間點堅強腸球菌SQ-3-2培養液1 mL于1.5 mL無菌離心管中，6 000 r/min離心10 min，使用無菌1 mol/L的KOH溶液調離心上清液pH至7.0，保留一個培養18 h的樣品不調酸，用于方法優化分析。將上述所有樣品通過0.2 μm無菌過濾器過濾，去除上清液中堅強腸球菌，獲得不同時間段堅強腸球菌SQ-3-2的無菌培養上清液，用于后續檢測。

30℃有氧條件下，將哈維氏弧菌BB170在2216海生菌培養基中活化2代，按1∶100的比例接種至AB培養基中，過夜培養后使用上述同樣方法制備哈維氏弧菌BB170無菌培養上清液，用于陽性對照。

1.2.2 堅強腸球菌SQ-3-2培養上清液中信號分子AI-2的檢測

發光檢測實驗方法據文獻［11］修改得到。30℃條件下，將哈維氏弧菌BB170在2216海生菌培養基中活化2代，按1∶100的比例接種至AB培養基中，有氧過夜培養。當培養基OD630nm吸光度值為0.6左右時，按照1∶1 000比例稀釋到新鮮AB培養基中，混勻備用。

新鮮AB培養基、哈維氏弧菌BB170過夜培養無菌上清液、新鮮MRS培養基和堅強腸球菌SQ-3-2培養至18h的調酸與未調酸的無菌培養上清液分別作為空白對照、陽性對照，MRS培養基對照和待測樣品，每個樣品分別按照1∶10的比例與過夜培養稀釋后的哈維氏弧菌BB170菌液混勻，設置兩個平行，繼續置于30℃有氧培養。0～7 h之內每0.5 h使用96孔酶標板于Perkin Elmer多功能酶標儀化學發光模式下(300～700 nm總光量)測定發光強度，同一塊酶標板再置于Thermo 96孔板酶標儀中測定OD630nm吸光度值，每板均取復孔，每孔加樣量為200 μL。

1.2.3 哈維氏弧菌BB170活菌數與OD630nm吸光度值關系

將30℃過夜有氧培養至OD630nm為0.6左右的哈維氏弧菌BB170稀釋1 000倍，稀釋后繼續置于30℃下有氧培養。每隔1h使用Thermo 96孔板酶標儀測定OD630nm吸光度值，同時取菌液梯度稀釋后涂平板計數。

1.2.4 堅強腸球菌SQ-3-2培養上清液中信號分子AI-2檢測的方法優化

將堅強腸球菌SQ-3-2培養18h上清液分為調酸(pH 7)與未調酸2 組，每一組均按照1∶10、1∶50 和1∶100的比例與1 000倍稀釋后的哈維氏弧菌BB170菌液混合均勻，取熒光強度差別最大的4h處測定各組不同加樣比例的熒光強度，測定方法同上。陽性對照加樣比例為1∶100。

1.2.5 堅強腸球菌SQ-3-2培養不同時間點信號分子AI-2的檢測

將上述制備好的6～24 h的10個時間點的堅強腸球菌SQ-3-2調酸培養上清液，按照1∶100的比例過夜培養后稀釋的哈維氏弧菌BB170菌液混勻，發光檢測方法同上，測定不同時間點堅強腸球菌SQ-3-2培養上清液中信號分子AI-2的活性。

2 結果與分析

2.1 堅強腸球菌SQ-3-2培養上清中AI-2信號分子的檢測

利用堅強腸球菌SQ-3-2培養18 h的調酸與未調酸無菌培養上清作為待測樣品進行發光檢測。實驗結果就熒光強度對孵育時間繪圖，見圖1。圖1中加樣比為1∶10，結果顯示前3 h各組的熒光強度均下降，其中未調酸待測樣品熒光強度顯著低于其他4組。此后，由于空白對照中的AI-2沒有達到一定濃度，其發光強度繼續降低。而堅強腸球菌SQ-3-2調酸組和陽性對照濾過上清熒光強度降低趨勢平緩，在熒光強度差別最大的4 h處，堅強腸球菌SQ-3-2調酸組熒光強度大于空白對照，小于陽性對照，說明待測樣品中含有AI-2，但由于方法或其他原因AI-2的濃度小于陽性對照。4 h后各組均呈現上升趨勢。在共同孵育4.5 h后，所有樣品的熒光強度均上升。

圖1 加樣比為1∶10的不同孵育時間各樣品的熒光強度Fig.1 The luminescence of different incubation time of samples ratio of 1∶10

圖2 加樣比為1∶10的不同孵育時間各樣品的OD630 nm吸光度值Fig.2 The OD630 nmabs of different incubation time of samples ratio of 1∶10

同時對不同時間點哈維氏弧菌BB170進行OD630nm吸光度測定，結果見圖2。結合圖3共同顯示，加樣比1∶10的未調酸待測樣品的OD630nm吸光度值并未發生明顯變化，說明其較大程度的抑制了哈維氏弧菌BB170的生長。其他樣品的吸光度值隨時間的增長逐漸變大，并保持在同一水平，說明其他4組對哈維氏弧菌BB170菌體生長影響不大，保證了不同時間點哈維氏弧菌BB170菌體數量在同一水平。說明堅強腸球菌SQ-3-2可以向細胞外釋放AI-2信號分子，并且使哈維氏弧菌BB170產生熒光。

圖3 哈維氏弧菌BB170活菌數與OD630 nm吸光度值的關系Fig.3 The relation between viable count of V.harveyi BB170 and OD630 nmabs

2.2 堅強腸球菌SQ-3-2培養上清中AI-2信號分子檢測的方法優化

選擇共同孵育后熒光強度強度差別最大的4 h處測定不同加樣比例各樣品的熒光強度，見圖4。結果顯示調酸待測樣品較未調酸樣品相對熒光強度大，其中調酸后加樣比為1∶100的待測樣品相對熒光強度最大且高于陽性對照，而未調酸加樣比為1∶10的待測樣品相對熒光為0。共同孵育4h處不同樣品的OD630nm吸光度值見圖5所示，除未調酸加樣比為1∶10的待測樣品外，其他各組OD630nm吸光度值均保持在同一水平，說明哈維氏弧菌BB170生長水平一致。

圖4 孵育4 h不同加樣比例各樣品相對熒光強度Fig.4 The relative luminescence of different sample ratio of incubation time 4 h

方法優化實驗結果說明，最優檢測條件為待測樣品 pH=7，加樣比例為1∶100。

2.3 堅強腸球菌SQ-3-2生長不同時期培養上清液中AI-2信號分子的濃度

使用優化后的檢測方案，我們測定了堅強腸球菌SQ-3-2培養不同時間點AI-2信號分子的濃度。由于在共同培養4 h的時候，對照與樣品之間熒光強度差別最大，故取各待測樣品(6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h)均于與哈維氏弧菌BB170同培養后4h測定，其相對熒光強度(相對熒光強度=樣品熒光強度/AB培養基作為空白對照)的熒光強度如圖6所示。結果結合圖7顯示，隨著培養時間的延長，堅強腸球菌的數量不斷增加，相對熒光強度也隨之增加，說明隨著堅強腸球菌菌群密度的增加，其分泌的信號分子AI-2的量也隨之提高，并在對數期末期達到最大值。當堅強腸球菌菌體密度超過一定范圍時，即進入穩定期后，檢測到的熒光強度則明顯下降。

圖5 孵育4 h不同加樣比例各樣品OD630 nm吸光度值Fig.5 The OD630 nmabs of different sample radio of incubation time 4 h

圖6 不同培養時間堅強腸球菌SQ-3-2上清相對熒光強度Fig.6 The relative luminescence of supernatant solution of E.durans SQ-3-2 in different incubation time

3 討論

3.1 哈維氏弧菌BB170的發光檢測

哈維氏弧菌BB170過夜培養后產生大量AI-2信號分子誘導自身菌體產生熒光，稀釋1 000倍后，熒光物質隨時間推移逐漸淬滅，到4 h左右熒光強度降低到最低值，之后隨著菌體的生長其自身開始合成AI-2信號分子，并誘導菌體大量產生熒光物質發光。若哈維氏弧菌BB170在熒光淬滅的過程中，周圍環境中存在有大量AI-2信號分子，這些AI-2可以誘導菌體產生部分熒光物質，故其熒光淬滅過程變化較為緩慢，依據這一原理可以指示出周圍環境存在AI-2信號分子。本研究探討了堅強腸球菌SQ-3-2是否可以合成并分泌AI-2。依據文獻［12］的研究發現，大量乳酸菌產生AI-2信號分子的最大值均出現在對數期末期，故我們選擇了堅強腸球菌SQ-3-2對數生長末期18h的培養上清進行了檢測。發現加入樣品后，由于空白對照中的AI-2濃度不足以使哈維氏弧菌BB170發出熒光，其熒光強度曲線呈下降趨勢，而哈維氏弧菌BB170和陽性對照的熒光強度曲線下降趨勢不明顯。該結果表明堅強腸球菌SQ-3-2濾過上清液和陽性對照相同，均含有足夠劑量的AI-2，從而使哈維氏弧菌BB170在被自身產生的AI-2誘導前發出熒光。在共同孵育4.5h后，由于哈維氏弧菌BB170本身能夠產生AI-2，所有樣品隨著哈氏弧菌BB170產生AI-2濃度的升高，熒光強度均上升。由于最終所有樣品都會發出最高強度的熒光，所以，待檢測的樣品務必于哈氏弧菌BB170被自身產生的AI-2誘導發光前進行檢測。

圖7 不同培養時間堅強腸球菌SQ-3-2的OD630 nm吸光度值Fig.7 The OD630 nmabs of E.durans SQ-3-2 in different incubation time

3.2 檢測條件的優化

依據文獻［13］的研究發現，哈維氏弧菌BB170構成的AI-2檢測體系的最佳pH值應與其自然生長下的pH值相同，過酸或者過堿均會對指示菌的發光性產生影響，而哈維氏弧菌BB170自然生長下的pH值大約在7左右。故在檢測條件優化實驗中，未調酸待測樣品按1∶10加樣比例添加，由于酸度過大，超過了AB培養基磷酸鹽緩沖體系的緩沖范圍，導致培養基pH值下降，對哈維氏弧菌BB170產生熒光和菌體生長不利，故不采用。調酸后的待測樣品按照1∶10和1∶50比例添加，由于培養上清液中含有大量抑菌物質和其他發酵產物，可能對哈維氏弧菌BB170繼續產生熒光有影響，故也不采用。故從最優角度出發，選擇將待測樣品調整酸度至pH=7，按照1∶100的加樣比例添加。此時體系中既含有足夠量的AI-2信號分子誘導哈維氏弧菌BB170產生熒光，同時又避免了培養上清液中酸度和抑菌物質對指示菌的影響。

3.3 堅強腸球菌SQ-3-2生長不同時期培養上清液中AI-2信號分子的測定

在堅強腸球菌SQ-3-2生長不同時期培養上清液中AI-2信號分子的濃度實驗中，堅強腸球菌隨著菌體密度的增加向胞外分泌AI-2信號分子的數量也隨之增多，直到對數期末期到達最大值，進入穩定期之后AI-2信號分子數量開始減少。目前已知的報道中，大部分微生物菌種產生AI-2的峰值均出現在對數期末期，進入穩定期之后隨之減少，這可能是由于大量AI-2信號分子被菌體重吸收或附著在細胞膜表面，調控穩定期的某些重要生理功能。

我們通過生物發光實驗檢測到堅強腸球菌SQ-3-2的培養液可以誘導特異性檢測AI-2信號分子的哈維氏弧菌報告菌株BB170發光，證明了堅強腸球菌SQ-3-2的lux S基因具有活性，Lux S蛋白作為該菌AI-2合成過程中的關鍵酶發揮了作用。這為進一步研究堅強腸球菌SQ-3-2的AI-2及lux S基因的功能奠定了基礎。而檢測條件的優化實驗則為乳品科學中研究乳酸菌群體感應信號分子AI-2的檢測提供了一定的實驗基礎和理論依據，可以更好更清楚的了解多菌種發酵中菌種直接的相互作用和關系。

4 結論

(1)采用哈維氏弧菌BB170作為指示菌產生熒光方法可以檢測到堅強腸球菌SQ-3-2產生的信號分子AI-2，優化的檢測條件為待測樣品調節pH=7且加樣比為 1∶100。

(2)堅強腸球菌SQ-3-2可以向細胞外釋放AI-2信號分子，隨著堅強腸球菌菌群密度的增加，其分泌的信號分子AI-2的量也隨之提高，并在培養16h的對數期末期達到最大值。

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