發酵食品中氨基甲酸乙酯污染狀況調查與分析

龍順榮，周勇，酈明浩，譚錦萍，楊曉云

1(廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東廣州，510330)2(華南農業大學資源環境學院，廣東廣州，510642)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)存在于飲料酒、焙烤食品、調味品等發酵食品中，是發酵過程副產物，早在1943年被Nettleship證實為一種多位點致癌物，會導致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病［1－2］，并影響人體免疫系統，乙醇對EC的致癌性有促進作用［3－4］，2007 年國際癌癥研究機構(IARC)指出，EC對人類的致癌毒性為2A群［5］。1985年加拿大最先規定酒中EC限量，隨后美、德、法、韓等國都相應規定EC含量限值，2002年聯合國糧農組織(FAO)將EC列為重點監控物質，并制定國際標準，我國已經制定飲料酒中EC的檢測標準，但沒有制定發酵食品EC的限值［6－15］。本研究采用液液萃取和基質固相分散的樣品前處理技術，應用氣相色譜-串聯質譜的檢測方法，開展流通領域發酵食品中EC的污染狀況調查，為發酵食品中EC的風險評估和制定限值提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究的樣品來源于流通領域，主要分析流通領域中飲料酒、焙烤食品和調味品中EC的污染狀況，共采集發酵食品437批次，其中62批次葡萄酒，37批次黃酒，3批次果酒，4批次啤酒，73批次蒸餾酒，45批次配制酒，109批次醬油，75批次醋，29批次面包。

1.2 儀器與試劑

Agilent 7000A三重四級桿氣相色譜-串聯質譜儀:配有Agilent Masshunter化學工作站，美國安捷倫公司;Eyela SB-1100旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司;Milli-Q超純水器，美國Millipore公司;Sigma 3－18K高速離心機，德國SIGMA公司;DC-12氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司。

二氯甲烷、正己烷、無水Na2SO4、活性炭、NaCl:分析純，廣州化學試劑廠;硅藻土:化學純，廣州市產品質量檢驗技術開發公司進口分裝;硅膠:60～100目，國藥集團化學試劑有限公司;氨基甲酸乙酯標準品:≥99%，美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 氣相色譜-串聯質譜條件

色譜條件:毛細管柱DB-225MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm，進樣口溫度 230℃，氦氣流速 1.0 mL/min，不分流，初始溫度50℃保持1 min，以8℃/min升至120℃，以40℃/min升至230℃保持10 min。

質譜條件:EI離子源溫度300℃，傳輸線溫度230℃，溶劑延遲8 min，碰撞氣:氦氣1.5 mL/min、氮氣2.25 mL/min，碰撞能量25eV;采用MRM方式進行定性定量，母離子m/z 62，定量離子m/z 44，定性離子m/z 45。

1.4 標準儲備液和標準系列溶液配制

稱取適量的氨基甲酸乙酯標準品于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷稀釋定容，使該溶液每毫升含氨基甲酸乙酯1 mg，冷藏于冰箱中，有效期2個月。分別吸取適量的氨基甲酸乙酯標準貯備液于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，配成 10 μg/L，50 μg/L，100 μg/L，250 μg/L，500 μg/L，1 000 μg/L 標準工作曲線。

1.5 樣品處理

1.5.1 飲料酒

取20.0 mL酒于150 mL分液漏斗中，加入20 mL水和適量NaCl使樣品達到飽和，再加20 mL正己烷，振搖5 min，靜置分層后用吸管吸出正己烷層，棄去，然后用50 mL×3次二氯甲烷萃取，振搖5 min，合并有機相過無水Na2SO4，濃縮至3 mL左右，轉入10 mL刻度試管中，用少量二氯甲烷洗滌濃縮瓶2至3次，洗滌液轉入試管中，氮吹，定容至5.0 mL，過濾上機。

1.5.2 焙烤食品、調味品

取5.0 g樣品于裝有10 g硅藻土∶無水Na2SO4(1∶1)的研缽中研勻。向玻璃層析柱中依次加入1 cm無水Na2SO4、0.5 g 10%活性炭硅膠、1 cm無水Na2SO4、樣品、2 cm無水Na2SO4。打開層析柱活塞，加入40 mL正己烷洗脫非極性成分，流速控制為8 mL/min，棄去流出液，加入100 mL二氯甲烷洗脫，流速最大時收集洗脫液，濃縮至3 mL左右，轉入10 mL刻度試管中，用少量二氯甲烷洗滌濃縮瓶2至3次，洗滌液轉入試管中，氮吹，定容至5.0 mL，過濾上機。

2 結果與分析

2.1 標準曲線和方法檢出限

以EC的子離子m/z 44峰面積與其對應濃度作線性回歸，得標準曲線為y=21.8922x－75.2654，相關系數r=0.9995，EC在10～1 000 μg/L范圍內具有良好的線性關系，說明本方法可以對發酵食品中EC進行準確的定性定量分析，以標準品在儀器上最低可檢出的濃度代入前處理過程中計算飲料酒中EC方法檢出限為1.0 μg/L，焙烤食品和調味品為5.0 μg/kg。

2.2 方法回收率及精密度

選取EC含量較低的樣品為基底樣品，根據方法檢出限和樣品實際檢出范圍，進行不同濃度加標回收實驗，每類樣品按照1.5的方法進行樣品前處理，平行測定5次，按照1.3小節的條件測定EC的含量并計算樣品回收率及其平均值和相對標準偏差，具體結果見表1。

表1 回收率和精密度測定結果(n=5)Table 1 Determination results of recovery and precision(n=5)

2.3 樣品處理

飲料酒前處理靜置后若二氯甲烷和水層不能分離，出現乳化嚴重現象，可以先將樣品轉入離心管中離心分層，再緩緩轉入分液漏斗中。焙烤食品、調味品前處理僅僅以硅藻土為吸附劑，以二氯甲烷為洗脫劑，則洗脫劑的用量比較大，且洗脫下來的油脂、色素和其他雜質較多，以1∶1的硅藻土－無水Na2SO4為吸附劑，可以達到吸附效果，并且在玻璃層析柱中占用體積小，使得洗脫劑的用量減少而降低其它雜質，用10%活性炭硅膠不但可以吸附色素，也可以吸附雜質。由于氨基甲酸乙酯具有升華的性質，樣品濃縮和氮吹時水浴溫度不要超過40℃，不能濃縮或者氮吹干，濃縮和氮吹時溶液體積不要少于3 mL，否則會影響氨基甲酸乙酯的回收率。

2.4 樣品中EC污染狀況

本研究樣品來源于廣東省流通領域，基本上涵蓋了主要的發酵食品分布情況，具有良好的代表性，本研究共監測437批次發酵食品，其中陽性樣品343批次，陽性率為78.49%，具體情況見表2。

共監測224批次飲料酒，各類飲料酒中EC平均值從高到低依次為黃酒、保健酒、果酒、高粱酒、米酒、料酒、雙蒸酒和葡萄酒，其中最高黃酒為90.4 μg/L，其次為保健酒62.9 μg/L，最低葡萄酒為7.6 μg/L;按食品類別統計含量最大值，最高值為保健酒255.1 μg/L，其次為黃酒228.2 μg/L，最低值為雙蒸酒17.2 μg/L;按照陽性率統計，最高為果酒100%，其次是黃酒78.38%，最低為啤酒未檢出 EC。對照加拿大1985年制定的葡萄酒EC限值(30 μg/L)，葡萄酒超標率為1.6%(1/62)，對照加拿大日本清酒EC限值(200 μg/L)，黃酒超標率為 5.4%(2/37)，對照加拿大蒸餾烈酒EC限值(150 μg/L)，保健酒超標率為7.1%(2/28)，其它飲料酒均低于限值要求。表2數據說明黃酒和保健酒中EC含量的平均值和超標率較高，其原因跟黃酒、保健酒的釀造與存儲有關，飲料酒中EC主要來源是尿素和乙醇反應生成，黃酒和保健酒在煎酒過程中由于工藝需要高溫提高其穩定性，造成尿素和乙醇加速反應，形成更多EC，同時保健酒需要長時間的浸泡(提取保健材料中的有效成分)、黃酒也需要長時間窖藏，使酒液中的尿素和乙醇繼續反應，造成成品中EC含量偏高。

表2 不同發酵食品中氨基甲酸乙酯污染狀況Table 2 Residue levels of ethyl carbamate in different fermented foods

共監測184批次的調味品，醬油和醋中EC平均值分別為 84.1 μg/kg、76.2 μg/kg，中位值分別為76.3 μg/kg、52.3 μg/kg，陽性率分別為 98.17% 和86.67%，以上數據表明醬油和醋中EC的含量高并且檢出率高，需要重點地監測和關注。共監測29批次的焙烤食品，面包中EC平均值為24.3 μg/kg，中位值為22.2 μg/kg，陽性率為72.41%。目前對飲料酒中EC的形成機理研究較多，而對醬油、醋、面包等其它發酵食品的形成機理研究非常少，其氨基甲酸乙酯的形成機理還需要進一步研究。

3 結論

本研究結果表明，大部分發酵食品均存在EC的污染，平均含量最高的是黃酒，其次是醬油和醋，同時醬油和醋中EC的陽性率也相對較高，在今后的研究和檢測中需要重點關注。以上數據為我國發酵食品中EC的安全性評估提供了基礎數據支持。

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