產α-葡萄糖苷酶抑制劑乳酸菌的篩選及發酵條件優化

韓 瑨，季 紅，周方方，吳正鈞

乳業生物技術國家重點實驗室光明乳業股份有限公司，上海200436

Ⅱ型糖尿病，又稱非胰島素依賴型糖尿病，占糖尿病總數的85%以上，主要由胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷造成，相比Ⅰ型糖尿病(胰島素依賴型)只能依賴注射胰島素來完成糖代謝的單一治療方法，Ⅱ型糖尿病可選擇胰島素增敏劑、促胰島素分泌劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-GI)等多種方式來對餐后血糖進行調控。由于促胰島素分泌劑往往伴有低血糖［1］、體重增加［2］等副作用，而胰島素增敏劑又會加大患者的心血管疾病的風險［3］，因此，調控作用溫和持久、毒副作用小甚至無毒的α-GI成為目前治療Ⅱ型糖尿病的首選藥物。

麥芽糖酶(maltase，EC 3．2．1．20)是一類典型的α-葡萄糖苷酶，它可從低聚糖類底物(麥芽糖)的非還原性末端切開α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖(如圖1)。人體小腸中的麥芽糖經麥芽糖酶作用生成葡萄糖，再經主動運輸被腸上部粘膜細胞吸收入血液，因此，借助α-GI抑制小腸體內的麥芽糖酶活性的方式來降低淀粉質食物在腸道消化吸收的效率，是調節餐后血糖水平的有效方法。

到目前為止，經過體外模型篩選，已經有120多種藥用植物被證明含有α-GI，并且其中三分之一藥用植物所含的活性單體已經被確認［4］。Dong-Sun Lee等從大豆中獲得一種異黃酮Genistein(金雀異黃酮，4，5，7-三羥異黃酮)對 α-糖苷酶有抑制活性［5］。此外，海洋無脊椎動物(如海筒螅、海燕、刺參和毛蚶)的粗提物也表現出對(-葡萄糖苷酶較強的抑制活性。與上述植物和動物來源的α-GI相比，微生物來源的α-GI的研究報導較少，大部分研究工作集中于放線菌(阿卡波糖、伏格列波糖的產生菌)、芽孢桿菌(米格列醇的產生菌)以及鏈霉菌(脫氧野尻霉素的產生菌)，而關于乳酸菌產物降血糖的報道數量相當有限。因此，本研究從篩選高產乳酸菌、優化發酵條件、提高產量入手，對乳酸菌來源的α-GI進行了初步研究。

圖1 麥芽糖酶催化麥芽糖水解為葡萄糖Fig.1 Hydrolysis ofmaltose to glucose catalyzed by maltase

1 材料與方法

1．1 菌種與試驗材料

菌種:植物乳桿菌ST-III(L．plantarumCGMCC 0847，由光明乳業股份有限公司提供)，L．plantarumATCC14917、L．caseiATCC393、L．caseiATCC334(從ATCC 購買)，L．plantarumWCFS1(從 TI Food and Nutrition，Wageningen，Netherlands購買)，L．bulgaricusLB-340(由丹尼斯克公司提供)，S．thermophilusST-BODY-3(由科·漢森有限公司提供)。

試驗材料:MRS培養基(Merck，德國)，M17液體培養基(Merck，德國)，大豆(Glycine max Merrill)，1 mol/L氫氧化鈉溶液，麥芽糖(Sigma，美國)、麥芽糖酶(EC 3．2．1．20，Sigma，美國)、葡萄糖測定試劑盒(普利萊基因技術有限公司，中國)。

1．2 試驗方法

1．2．1 發酵種子液的制備

分 別 將L．plantarumST-III、L．plantarumATCC14917、L．plantarumWCFS1、L．bulgaricusLB-340、L．caseiATCC334、L．caseiATCC393 接種于 MRS液體培養基，S．thermophilusST-BODY-3接種于M17液體培養基，37℃靜置培養24 h后，培養物9，000 rpm離心10 min，棄去上清，菌體用無菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養體積相同的無菌蒸餾水懸浮，混勻后即得發酵種子液。

1．2．2 活菌計數方法

采用MRS平板計數法

1．2．3 豆漿的制備

將大豆與水按1∶9(w/v)的比例配置，于37℃浸泡8 h，棄去水，補充與棄去水相同體積的蒸餾水，用豆漿機制得固形物含量為10%(w/v)的豆漿，經蒸餾水稀釋至指定固形物濃度，118℃、15 min滅菌，得到指定固形物濃度的無菌大豆豆漿。

1．2．4 發酵樣品預處理

發酵豆漿樣品沸水浴5 min滅活后，冷卻至室溫，用1 mol/L NaOH 調至 pH 6．80，15，000 rpm 離心10 min，取上清，即得預處理樣品，置于-85℃深冷冰箱保存以備檢測。

1．2．5 對麥芽糖酶抑制活性的測定

采用葡萄糖測定試劑盒-氧化酶法(GOD法)［6］，如表1所示，按從上而下的順序依次加入各試劑，搖勻，置于37℃水浴保溫30 min，沸水浴5 min反應終止后，15，000 rpm離心2 min，取上清按1∶39(v/v)與葡萄糖測定試劑盒工作溶液混合，搖勻，37℃水浴20 min，測定在λ =550 nm(Specord 205，Jena，德國)的吸光度，根據葡萄糖標準曲線計算各管中葡萄糖的含量。發酵豆漿樣品對麥芽糖酶的抑制活性按下列公式計算:

其中A:加入空白樣品后麥芽糖酶反應體系中葡萄糖的含量;

B:空白樣品原有的葡萄糖含量;

C:加入待測樣品的麥芽糖酶反應體系中葡萄糖的含量;

D:待測樣品原有的葡萄糖含量。

1．2．6 乳酸菌的篩選

根據1．2．3所述方法，制備固形物含量為5%(w/v)的無菌豆漿。然后按2%(v/v)接種量接入1．2．1中所述各菌株的發酵種子液，37℃培養24 h，分別在16 h和24 h取樣獲得發酵豆漿樣品。上述發酵豆漿樣品經1．2．4所述方法預處理后，測定其對麥芽糖酶的抑制效果。

表1 樣品對麥芽糖酶抑制作用的測定Table 1 The inhibitory effects of samples on maltase activity

1．2．7 不同接種量對發酵大豆豆漿產物抑制麥芽糖酶活性的影響

分別將植物乳桿菌ST-III的發酵種子液(活菌總數為 1．0 ×109cfu/mL)按 0．5%、1%、2%、4%(v/v)的接種量接入固形物含量為5%(w/v)的滅菌大豆豆漿中，接種后植物乳桿菌的活菌數為5．0×106至4．0×107cfu/mL，37 ℃靜置培養 48 h，間隔取樣，樣品經預處理后，測定其對麥芽糖酶的抑制效果。

1．2．8 發酵不同濃度大豆豆漿的產物對麥芽糖酶抑制活性的影響

將植物乳桿菌ST-III的發酵種子液以2%(v/v)接種量無菌操作分別接入固形物含量為3%、5%、7%、9%(w/v)的滅菌大豆豆漿中，37℃靜置48 h，間隔取樣，樣品經預處理后，測定其對麥芽糖酶的抑制效果。

1．2．9 不同溫度下發酵大豆豆漿的產物對麥芽糖酶抑制活性的影響

將植物乳桿菌ST-III的發酵種子液以2%(v/v)接種量無菌操作接入固形物含量為5%(w/v)的滅菌大豆豆漿中，分別在25、30、37、40℃靜置培養48 h，發酵終點的豆漿樣品經預處理后，測定其對麥芽糖酶的抑制效果。

1．2．10 優化條件下獲得的大豆豆漿發酵產物對麥芽糖酶抑制活性的影響

在固形物含量5%(w/v)的滅菌大豆豆漿中，以2%(v/v)接種植物乳桿菌ST-III的發酵種子液，37℃靜置培養24 h，測定不同時間的發酵豆漿經預處理后的樣品對麥芽糖酶的抑制作用。

2 結果與討論

2．1 乳酸菌的篩選

不同乳酸菌的發酵種子液以2%(v/v)接種量接入固形物含量為5%(w/v)的無菌大豆豆漿中，37℃培養24 h，測定在16 h和24 h獲得的發酵豆漿經預處理后的樣品對麥芽糖酶的抑制效果，結果如圖2所示。

圖2 不同乳酸菌的豆漿發酵產物對麥芽糖酶的抑制效果Fig.2 Maltase inhibition activities of fermented soybeanmilk by different Lactic acid bacteria

三株植物乳桿菌的對麥芽糖酶抑制效果顯著，為50% ～75%，其中，植物乳桿菌ST-III發酵大豆豆漿后的產物對麥芽糖酶抑制能力最強，達到75%，L．plantarumATCC14917與L．plantarumWCFS1抑制麥芽糖酶的效果僅次于ST-III，分別為50%和55%，其他2株干酪乳桿菌、1株保加利亞乳桿菌、1株嗜熱鏈球菌發酵產物的抑酶效果為20～30%，與3株植物乳桿菌發酵產物的抑制能力差異較明顯。表明植物乳桿菌ST-III是一株適合于通過發酵豆漿制備α-GI的優良菌株，同時，上述結果也表明植物乳桿菌發酵豆漿對麥芽糖酶普遍具有較高的抑制效果。

2．2 不同接種量對發酵大豆豆漿產物抑制麥芽糖酶活性的影響

將植物乳桿菌ST-III的發酵種子液以不同接種量接入固形物含量為5%(w/v)的滅菌大豆豆漿，37℃靜置培養48 h，測定在不同時間獲得的發酵豆漿經預處理后的樣品對麥芽糖酶的抑制作用，結果如圖3所示。

圖3 不同接種量的豆漿發酵產物對麥芽糖酶抑制率的影響Fig.3 Impact of inoculum ratios on maltase inhibitory rates of fermented soybeanmilk

從圖3可以看出，在發酵前10 h，接種量越高，植物乳桿菌ST-III的發酵豆漿產物對麥芽糖酶的抑制作用越強，抑制物的生成速率與接種量大小呈正相關的關系。

在發酵終點處，不同接種量獲得的發酵產物對麥芽糖酶的抑制效果處于同一水平(66% ～72%)，無顯著差異(P＞0．05)，這說明具有抑酶能力的代謝產物生成量與豆漿中的營養物質含量有關，與ST-III接種量無關，但接種量的大小與抑制率峰值出現時間有關，從圖中可以看出，接種量越大，抑制率達到峰值所需時間越短，如4．0%(v/v)接種量的豆漿發酵產物在9 h就達到最強抑制效果72%，而0．5%(v/v)接種量的豆漿發酵產物出現抑制率峰值的時間為20 h，與前者相比延后11 h。此外，比對2．0%(v/v)和4．0%(v/v)接種量終點處的發酵產物對麥芽糖酶的抑制效果，結果表明兩種接種量對抑制率的影響無顯著差異(P＞0．05)。因此，后續實驗均采用2．0%(v/v)接種量作為最適接種量。

2．3 發酵不同濃度大豆豆漿的產物對麥芽糖酶抑制活性的影響

將植物乳桿菌ST-III的發酵種子液以2%(v/v)接種量分別接入不同固形物含量的無菌豆漿中，37℃靜置培養2 d，測定在不同時間獲得的發酵豆漿經預處理后的樣品對麥芽糖酶的抑制效果，結果見圖4。

圖4 豆漿濃度對麥芽糖酶抑制率的影響Fig.4 Impact of solid contents of soybean milk on maltase inhibitory rates

在發酵前10 h，隨著發酵時間的延長，相同接種量、不同固形物含量的發酵產物對麥芽糖酶的抑制率效果均呈現上升趨勢，豆漿濃度越高，發酵相同時間獲得的發酵產物對麥芽糖酶抑制作用越顯著。

在發酵10 h后，不同固形物含量的發酵產物對麥芽糖酶的抑制率達到峰值后，維持至發酵終點，來自3%(w/v)、5%(w/v)、7%(w/v)、9%(w/v)的各樣品對麥芽糖酶抑制率峰值分別為55%、66%、68%、74%。這可能是因為固形物含量高的豆漿中，可被植物乳桿菌ST-III用于合成麥芽糖酶抑制物的成分越多，其發酵產物抑制作用越強。

固形物含量9%(w/v)的豆漿容易在加熱或滅菌時發生暴沸，對后續試驗產生不利影響。因此，棄用9%(w/v)的豆漿。對比固形物含量為5%(w/v)和7%(w/v)的豆漿終點處樣品對麥芽糖酶的抑制率差異不顯著(P＞0．05)，因此，選用5%(w/v)為最適的豆漿濃度。

2．4 不同溫度下發酵大豆豆漿的產物對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

在固形物含量5%(w/v)的滅菌大豆豆漿中，以2%(v/v)接種量接種植物乳桿菌ST-III的發酵種子液，分別在不同溫度靜置培養48 h，測定在終點處發酵豆漿經預處理后的樣品對麥芽糖酶的抑制作用，結果見圖5。

圖5 發酵溫度對麥芽糖酶抑制率的影響Fig.5 Impacts of fermentation temperature on maltase inhibitory rates of fermented soybean milk

如圖所示，植物乳桿菌ST-III在37℃時培養24 h后的大豆豆漿發酵產物對麥芽糖酶的抑制效果高于其他溫度下獲得的發酵產物，其抑制率為82%。這可能是由于37℃發酵更有利于植物乳桿菌STIII利用大豆豆漿代謝產生相關(-葡萄糖苷酶抑制產物。因此，37℃是植物乳桿菌ST-III發酵大豆豆漿產的最適發酵溫度。

2．5 優化條件下獲得的大豆豆漿發酵產物對麥芽糖酶抑制活性的影響

在固形物含量5%(w/v)的滅菌大豆豆漿中，以2%(v/v)接種量接種植物乳桿菌ST-III的發酵種子液，37℃靜置培養24 h，測定不同時間的發酵豆漿經預處理后的樣品對麥芽糖酶的抑制作用，結果見圖6。

圖6 優化條件下的豆漿發酵產物對麥芽糖酶的抑制率Fig.6 Maltase inhibitory rates of soybeanmilk fermented by L．plantarum ST-III at optimized condition

如圖所示，在優化的發酵條件下，植物乳桿菌ST-III發酵8 h后的發酵產物對麥芽糖酶抑制率達到峰值，為81．5%，并且這種高抑制效果可以穩定維持到發酵終點。

3 討論

盡管乳酸菌的免疫調控［7］、促進吸收［8］、疾病預防［9］等益生作用都已被深入的研究過，但到目前為止，關于乳酸菌或其代謝產物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的報道非常少［10，11］，而且，鑒于大部分植物乳桿菌在乳制品中快速增殖能力差的特點，有關植物乳桿菌對α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究更是鳳毛麟角。

本實驗從多株乳酸菌出發，以大豆豆漿為發酵基料，研究其代謝產物對α-葡萄糖苷酶的抑制能力。結果發現，被測乳酸菌在大豆豆漿中的發酵產物對麥芽糖酶均有一定的抑制效果，其中，由植物乳桿菌ST-III發酵獲得的大豆豆漿樣品對麥芽糖酶的抑制率最高，該菌株可以作為利用大豆豆漿制備α-GI的優良菌株。Haiping Li等研究了干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、動物雙歧桿菌等六株益生菌在豆漿中的發酵特性，發現異黃酮(isoflavone)的含量在發酵過程中有顯著增加［12］。Chun Whan Choi等比較了多種大豆異黃酮的α-葡萄糖苷酶抑制活性，結果表明異黃酮類物質對酵母來源的α-糖苷酶均有明顯的體外抑制效果［13］。Haiping Li和 Chun whan Choi的研究成果，為本實驗豆漿發酵產物中具有α-糖苷酶抑制活性的主要成分提供了思路。

通過對發酵條件進一步優化，植物乳桿菌STIII發酵大豆豆漿8 h獲得的產物對麥芽糖酶的抑制效果即可達到80%左右，由此可見，微生物的這種快速、高效合成活性抑制物的能力是植物所無法企及的，鑒于微生物的這一特點，植物乳桿菌ST-III大豆豆漿發酵物中所含有的潛在抗高血糖或抗糖尿病作用值得進一步的研究。

4 結論

植物乳桿菌ST-III發酵大豆豆漿具有顯著的α-糖苷酶有抑制活性，其發酵大豆豆漿產生麥芽糖抑制產物的最適發酵條件為接種量2%(v/v)、基料固形物含量5%(w/v)、發酵溫度37℃，在上述優化條件下，8 h的豆漿發酵產物對麥芽糖酶的抑制效果可達80%左右。

1 ADVANDCE Collaborative Group，Patel A，MacMahon S，et al．Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patientswith type2 diabetes．N Engl JMed，2008，358(24):2560-2572．

2 Turner RC，Holman RR，Cull CA，et al．Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes(UKPDS 33)．Lancet，1998，352:837-853．

3 Wagstaff AJ，Goa KL．Rosiglitazone:a review of its use in the management of type 2 diabetes mellitus．Drugs，2002，62:1805-1837．

4 Ji F(季芳)，Xiao GC(肖國春)，Dong L(董莉)，et al．Development ofα-glucosidase inhibitor from medicinal herbs．Zhongguo Zhong Yao Za Zhi(中國中藥雜志)，2010，35:1633-1640．

5 Lee DS，Lee SH．Genistein，a soy isoflavone，is a potentαglucosidase inhibitor．FEBS Lett，2001，501:84-86．

6 Trinder P．Determination of blood glucose using an oxidaseperoxidase system with a noncarcinogenic chromogen．JClin Pathol，1969，22:158-161．

7 Kimoto H，Mizumachi K，Okamoto T，et al．New lactococcus strain with immunomodulatory activity:enhancement of Th1-type immune response．Microbiol Immunol，2004，48(2):75-82．

8 Jasna M，Tatjana P，Lidija B，et al．Zinc binding by lactic acid bacteria．Food Technol Biotechnol，2009，47:381-388．

9 Caramia G．Gastroenteric pathology and probiotics:from myth to scientific evidence．Current aspects．Minerva Gastroenterol Dietol，2009，55:237-272．

10 Apostolidis E，Kwon YI，Ghaedian R，et al．Fermentation of milk and soymilk byLactobacillus bulgaricusandLactobacillus acidophilusenhances functionality for potential dietary management of hyperglycemia and hypertension．Food Biotechnol，2007，21:217-236．

11 Ramchandran L，Shah NP．Proteolytic profiles and angiotensin-I converting enzyme and alpha-glucosidase inhibitory activities of selected lactic acid bacteria．J Food Sci，2008，73(2):75-81．

12 Li HP，Yan LY，Wang JC，et al．Fermentation characteristics of six probiotic strains in soymilk．Ann Microbiol，2012，Accepted．

13 Choi CW，Choi YH，Cha M，etal．Yeastα-glucosidase inhibition by isoflavones from plants of leguminosae as anin vitroalternative to acarbose．J Agric Food Chem，2010，58:9988-9993．