天麻成分對羥基苯甲醛抗血小板聚集作用及急性毒性研究

李秀芳，代 蓉，李國花，2，雷 娜，林 青*

1云南中醫(yī)學院藥理教研室，昆明650200;2云南省大理白族自治州人民醫(yī)院，大理671000

對羥基苯甲醛是蘭科植物天麻(Gastrodia elataBlume．)的主要化學成分之一，課題組前期的研究表明，天麻乙酸乙酯提取物具有較強的抗血小板聚集活性［1］，將天麻乙酸乙酯提取物進行硅膠柱色譜分離，得到一組酯溶性酚性成分，對該組成分進行抗血小板聚集活性篩選后初步確定，對羥基苯甲醛為主要的活性成分，本文對對羥基苯甲醛的體外、體內抗血小板聚集活性進行了研究，并對其經口給藥的急性毒性進行了考察。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1．1．1 藥物與試劑

對羥基苯甲醛，上海百靈威科技有限公司，批號:LB20K01，純 度 99%;ADP(Sigma，批 號:A2754);AA(Sigma，批號:A9673);PAF(Sigma，批號:D00080940);阿司匹林，山東新華制藥有限股份公司，批號:09795;吐溫-80(化學純CP)，國藥集團化學試劑有限公司，批號:F20090324;水合氯醛(分析純)，天津市瑞金特化學品有限公司，批號:20090814;枸櫞酸鈉，天津市化學試劑三廠，批號:091107。

1．1．2 動物

昆明種小鼠，清潔級，雌雄各半，體重18～22 g，批號:Dossy-2011-03;健康家兔，雌雄各半，體重2～2．5 kg，生產批號:Dossy-2009-10;雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠，清潔級，體重 250 ～300 g，生產批號:Dossy-2011-01，所有動物均由四川省醫(yī)學科學研究院動物研究所提供，飼養(yǎng)條件:室溫為22±2℃，相對濕度60%～70%。

1．1．3 儀器

LBY-NJ2血液凝聚儀:北京普利生儀器有限公司;賽多利斯XS125A分析天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 對羥基苯甲醛對ADP、AA和PAF誘導的家兔體外血小板聚集的影響

36只家兔隨機分為6組，即溶媒對照組(1%吐溫-80)、對羥基苯甲醛5個濃度組。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉家兔，自頸總動脈取血，收集于一次性塑料試管中，采用3．2%枸櫞酸鈉抗凝，血液與抗凝劑容積比為9∶1，取血后立即顛倒混勻，血液于室溫分別采用200×g離心6min，得富血小板板血漿(platelet rich plasma，PRP)，剩余血液再以1000×g離心15 min，得貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，按 Born 氏比濁法［2］，分別以 ADP、AA、PAF為誘導劑，采用血小板聚集儀測定5 min內血小板最大聚集率。血小板聚集抑制率按下式計算:聚集抑制率(%)=(1-給藥組聚集率/對照組聚集率)×100%。

1．2．2 對羥基苯甲醛抗ADP誘導的家兔體外血小板聚集作用的重現(xiàn)性考察

動物分組、取血、測定方法同1．2．1。血小板聚集誘導劑為ADP。

1．2．3 對羥基苯甲醛對ADP引起的小鼠急性肺栓塞的保護作用

方法［3］，取健康昆明種小鼠100只，雌雄各半，隨機分為5組，即溶媒組(1%吐溫-80)、模型組、陽性對照組(阿司匹林)、對羥基苯甲醛低劑量組、對羥基苯甲醛高劑量組，每組動物20只。以上各組動物(除陽性對照組外)均按分組灌胃給予相應劑量的受試藥物，每日一次，連續(xù)給藥3 d，于末次給藥后1 h，分別尾靜脈注射ADP生理鹽水液390 mg/kg，陽性對照組經尾靜脈一次注射給予阿司匹林后1 h，尾靜脈注射ADP生理鹽水液390 mg/kg，觀察30 min內動物死亡數。

1．2．4 對羥基苯甲醛對大鼠下腔靜脈血栓形成的影響

參考文獻方法［4］，取清潔級雄性SD大鼠，隨機分為4組，即模型組、陽性對照組(阿司匹林)、對羥基苯甲醛低劑量組、對羥基苯甲醛高劑量組，每組8～9只。大鼠連續(xù)給予相應受試藥物7 d，模型組給予溶媒(1%吐溫-80)，末次給藥后30 min，大鼠以3%戊巴比妥鈉麻醉，腹部正中切口打開腹腔，分離下腔靜脈，用細絲線結扎，縫合腹腔，結扎4 h后，處死大鼠，打開腹腔，在結扎下方2 cm處用動脈夾夾閉下腔靜脈管腔，將結扎段血管剪下，剖開血管，輕輕取出血栓，放于濾紙上，吸干血液，用微量電子天平稱取血栓濕重。

1．2．5 對羥基苯甲醛經口給藥的急性毒性

經預試驗測得小鼠90%死亡率的致死量為1.80 g/kg體重，最小致死量為0．85 g/kg體重，在這兩個劑量之間，按1∶0．9的比例設置7個劑量組。正式試驗，取合格昆明種小鼠70只，雌雄各半，按體重隨機分7組，每組10只。試驗前禁食不禁水12小時，7 個給藥組小鼠分別按 1．80、1．62、1．46、1.31、1．18、1．06、0．96 g/kg，于 24 h 內一次灌胃給予對羥基苯甲醛溶液，給藥體積均為0．4 mL/10 g體重。密切觀察12 h。以后上、下午各觀察一次，連續(xù)觀察14 d，每天觀察各組小鼠的外觀、行為和毒性反應，并記錄各組小鼠的死亡數，采用Bliss法計算小鼠的半數致死量。

1．3 統(tǒng)計方法

采用SPSS13．0軟件進行統(tǒng)計，計量資料方差齊者采用t檢驗，方差不齊者采用t’檢驗;率的比較采用χ2檢驗。

2 結果與討論

2．1 結果

2．1．1 對羥基苯甲醛抗ADP、AA和PAF誘導的家兔體外血小板聚集的作用

結果顯示，對羥基苯甲醛能夠顯著對抗ADP誘導的家兔體外血小板聚集，其作用強度呈明顯的濃度依賴性特點，對AA誘導的血小板聚集僅高濃度時有效，而對PAF誘導的血小板聚集作用不明顯，提示，對羥基苯甲醛對ADP、AA、PAF三種途徑的血小板聚集具有選擇性的對抗作用，以對抗ADP途徑的血小板聚集作用最強，詳見表1。

表1 對羥基苯甲醛抗ADP、AA、PAF誘導的家兔體外血小板聚集作用± s，n=6)Table 1 Effect of4-HBAL on platelet aggregation induced by ADP，AA and PAF± s，n=6)

表1 對羥基苯甲醛抗ADP、AA、PAF誘導的家兔體外血小板聚集作用± s，n=6)Table 1 Effect of4-HBAL on platelet aggregation induced by ADP，AA and PAF± s，n=6)

注:給藥組與溶媒組相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。Note:Medicine group vs vehicle control group*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01．

聚集率(%)ADP AA PAF溶媒組Vehicle control group 1%吐溫組別Group藥物終濃度Final drug concentration(mg/mL)－80 46．60 ±4．64 56．27 ±3．54 53．55 ±4．91對羥基苯甲醛 4 －HBAL 0．4 8．47 ±4．10＊＊ 49．70 ±4．84* 48．25 ±3．69 0．2 31．92 ±4．71＊＊ 51．12 ±4．75 50．47 ±2．85 0．1 38．57 ±5．13* 52．58 ±3．73 51．37 ±2．74 0．05 40．03 ±3．83* 53．18 ±3．88 51．45 ±4．36 0．025 44．28 ±2．17 54．67 ±3．75 53．20 ±1．90

2．1．2 對羥基苯甲醛抗ADP誘導的家兔體外血小板聚集作用的重現(xiàn)性

結果顯示，對羥基苯甲醛能顯著性對抗ADP誘導的家兔體外血小板聚集，實驗結果重現(xiàn)性較好，經計算，其體外抗血小板聚集的IC50為2 mmol/L，詳見表2。

表2 對羥基苯甲醛抗ADP誘導的家兔體外血小板聚集作用重現(xiàn)性± s，n=6)Table 2 Reproducibility of effect on platelet aggregation induced by ADP of 4-HBAL± s，n=6)

表2 對羥基苯甲醛抗ADP誘導的家兔體外血小板聚集作用重現(xiàn)性± s，n=6)Table 2 Reproducibility of effect on platelet aggregation induced by ADP of 4-HBAL± s，n=6)

注:給藥組與溶媒組相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。Note:Medicine group vs vehicle control group，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01．

組別Group藥物終濃度Final drug concentration(mg/mL)ADP聚集率Aggregation rate(%)抑制率Inhibition rate(%)IC50溶媒組Vehicle control group 1%吐溫 －80 46．57 ±2．77 － 2 mmol/L對羥基苯甲醛 4 －HBAL 0．4 9．17 ±1．38＊＊ 80．31 0．2 32．50 ±2．05＊＊ 30．21 0．1 39．90 ±1．61* 14．32 0．05 41．92 ±1．70* 9．98 0．025 43．13 ±1．73 7．39

2．1．3 對羥基苯甲醛抗ADP引起的小鼠急性肺栓塞的作用

結果顯示，對羥基苯甲醛低劑能降低動物的死亡率，而高劑量組與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義作用不明顯，詳見表3。

表3 對羥基苯甲醛抗ADP引起小鼠急性肺栓塞的作用(n=18～20)Table 3 Effect on mice pulmonary embolism induced by ADP of4-HBAL(n=18-20)

2．1．4 對羥基苯甲醛抗大鼠靜脈血栓形成的作用

結果顯示，對羥基苯甲醛高、低劑量均能顯著減輕血栓濕重，對抗大鼠靜脈血栓形成。詳見表4。

表4 對羥基苯甲醛抗大鼠靜脈血栓形成的作用±s)Table 4 Effect on thrombosis of rat inferior vena cava of4-HBAL±s)

注:給藥組與模型組比較，*P ＜ 0．05，＊＊P ＜ 0．01。Note:Medicine group vsmodel group，*P ＜ 0．05，＊＊ P ＜ 0．01．

組別Group劑量Dose(mg/kg)動物數Number of animals血栓濕重Wetweight of thrombus(mg)-80 9 27．58 ±13．58陽性對照組 Positive control group 20 8 4．10 ±3．47＊＊對羥基苯甲醛高劑量組4-HBAL high dose group 20 9 3．73±2．96＊＊對羥基苯甲醛低劑量組4-HBAL low dose group 10 8 6．78±4．28模型組Model group 1%吐溫＊＊

2．1．5 對羥基苯甲醛經口給藥的急性毒性

結果顯示，小鼠灌胃給予對羥基苯甲醛后，中毒表現(xiàn)主要為身體及四肢顫抖，呼吸急促，俯臥不能走動直至死亡，死亡時間集中在給藥后2 h內，死亡動物大體解剖，肉眼觀察主要臟器，可見胃腸道充血。采用Bliss法計算小鼠的半數致死量，小鼠灌胃給予對羥基苯甲醛的 LD50為1．23 g/kg體重，LD50的95%可信限為 1．03 ～1．40 g/kg，詳見表5。

表5 小鼠經口給予對羥基苯甲醛的LD50Table 5 LD50 of 4-HBAL given through themouth

2．2 討論

血栓性疾病是一類嚴重危害人類健康和生命的疾病，其發(fā)病率、致殘率和致死率都很高，臨床上常見的血栓性疾病包括急性冠脈綜合征、急性缺血性腦血管病、糖尿病患者的血栓形成、血栓閉塞性脈管炎、急性腫瘤引起的血栓等。血小板的活化、聚集在血栓形成和發(fā)展過程中起著重要的作用，因此抗血小板聚集藥物也是上述血栓性疾病治療中的有效藥物之一。

對羥基苯甲醛是天麻的主要成分之一，也是一種重要的有機化工中間體，它的發(fā)現(xiàn)與合成已有近百年的歷史，在醫(yī)藥工業(yè)中，常用于多類藥物及中間體的合成，如抗生素阿莫西林的合成、袪痰藥杜鵑素的中間體對羥基肉桂酸的生產等［5］。課題組前期的研究提示，對羥基苯甲醛可能是天麻乙酸乙酯提取物中抗血小板聚集的主要活性成分之一，然而迄今為止，尚未見關于對羥基苯甲醛抗血小板聚集活性的報道。本研究結果顯示，對羥基苯甲醛在體內、體外均有抗血小板聚集活性，且其作用具有選擇性對抗ADP途徑的血小板聚集的特點;在對抗大鼠下腔靜脈血栓形成方面，同等劑量(20 mg/kg)情況下，對羥基苯甲醛的作用強度與陽性對照藥阿司匹林相當。

本研究結果提示，對羥基苯甲醛可能可以作為活性成分用于抗血栓性疾病藥物的開發(fā)，但需要注意的是，對羥基苯甲醛小鼠經口給藥具有一定的急性毒性，毒性表現(xiàn)以胃腸道刺激為主。

參考文獻

1 Yu ZP(淤澤溥)，Lin Q(林青)，Li XF(李秀芳)，et al．Effect and mechanism of ethyl acetate extract from Gastrodia elata Blume．on platelet aggregation induced by ADP．Chin Tradit Herbal Drugs(中草藥)，2007，38:743-745．

2 Born GV．Aggregation of blood platelet by diphosphate and its reversal．Nature，1962，194:927-929．

3 Li SQ(李圣青)，Zhang J(張艱)，Qi HW，et al．Establishment and comparison of different pulmonary embolism models in mice，Acad J Fourth Mil Med Univ(第四軍醫(yī)大學學報)，2004，25:1379-1382．

4 Chen Q(陳奇)．Methodology of pharmacological study of Chinese herbalmedicine(中藥藥理研究方法學)，Beijing:People’s Medical Publishing House，1993:510-511．

5 Li C(李超)，Wang GY(王桂英)，Yao RS(姚日生)．The application＆synthetical technology of p-hydroxybenzaldehyde．Anhui Chem Industry(安徽化工)，2008，34(3):17-19．