黃芪多糖對大鼠口腔潰瘍治療作用研究

王雪梅，薄 磊，祁 晶，余占海，馬興銘

1蘭州大學口腔醫學院;2蘭州大學基礎醫學院，蘭州730000

復發性阿弗他潰瘍(recurrent aphthous ulcer，RAU)也稱復發性口腔潰瘍，是口腔黏膜常見的潰瘍類疾病，主要發生于口腔內前庭、唇頰粘膜、軟腭、舌腹等非角化部位，以女性多發，在世界范圍內患病率高達 25%［1，2］，該病病因復雜，發病機理尚不清楚，近年來有學者認為免疫功能失調是RAU最重要的發病機制，增強機體免疫力，能夠減少潰瘍發作的頻率，縮短病程［3］。黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)作為中藥黃芪中重要的天然有效活性成分，具有抗應激、抗氧化、增強免疫功能等的免疫調節效應［4］。因此，本實驗通過建立SD大鼠RAU動物模型，觀察黃芪多糖對實驗性RAU的傷口愈合及淋巴細胞亞群的影響，為黃芪多糖在口腔潰瘍治療中的應用提供實驗研究依據。

1 材料與方法

1．1 RAU模型建立與分組

完全弗氏佐劑(美國Sigma公司);黃芪多糖(楊凌東科麥迪森制藥有限公司);抗CD4+-FITC、抗 CD8+-FITC(Multi Sciences Biotech Co，Ltd)。SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體重約200～250 g，購于甘肅省中醫學院實驗動物中心(合格證:醫動字第14-005號)。

將大鼠分實驗組(32只，雌雄各半)和正常對照組(8只)。正常對照組不給予任何處理，實驗組用免疫學方法建立RAU模型［5］:制備含完全弗氏佐劑的大鼠口腔黏膜組織抗原乳化液(放置后不分層)。實驗組大鼠脊柱兩側各選一點皮內注射黏膜組織抗原乳化液0．1 mL，每周1次，共注射4周。觀察大鼠口腔黏膜出現典型潰瘍病損時，即證實成功RAU動物模型。實驗組大鼠隨機分為黃芪多糖高、中、低劑量治療組及模型對照組，每組8只。

1．2 治療

黃芪多糖高(300 mg/kg)、中(200 mg/kg)、低(100 mg/kg)劑量治療組大鼠分別給予0．5 mL藥物溶液灌胃，模型對照組及正常對照組以等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續灌胃治療20 d。

1．3 測量潰瘍面直徑及潰瘍組織病理學檢查

觀察藥物治療前、治療20d后各組大鼠的口腔潰瘍面的直徑，記錄口腔潰瘍愈合的大鼠只數并計算愈合率，愈合標準［6］:潰瘍直徑＜1 mm為愈合，潰瘍直徑≥1 mm為未愈合。同時取正常大鼠口腔粘膜組織、造模成功后口腔潰瘍粘膜組織及治療后愈合大鼠口腔潰瘍黏膜組織，HE染色觀察潰瘍組織的病理學變化。

1．4 外周血T淋巴細胞亞群的測定

治療20 d后，乙醚麻醉大鼠，自眶靜脈取血，淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，并PBS洗滌并調成細胞懸液，按照試劑盒說明分別加標記的抗CD4+、CD8+單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞百分率。

1．5 血漿EGF含量的檢測

將血液標本用抗凝劑處理后(抗凝是血漿)，靜置30 min，于4℃下2500 rpm冷凍離心15 min，取上層血漿置-20℃貯存，酶聯免疫吸附法(ELISA)測定EGF含量，操作按說明書進行。

1．6 統計學分析

所有實驗數據用SPSS16．0統計軟件統計分析，結果用均數±標準差±s)表示。

2 結果

2．1 潰瘍面直徑及潰瘍組織病理學改變

大鼠在黏膜組織抗原注射后第3周，口腔黏膜局部充血、紅腫，至第4周出現潰瘍，并逐漸增大，多位于頰粘膜及牙齦部，直徑1．5～2．5 mm，邊緣整齊，表面有灰黃色假膜覆蓋。藥物治療20d后，與模型對照組相比(潰瘍直徑2．0 ±0．50 mm，愈合率為12．5%)，黃芪多糖藥物促進潰瘍面愈合，使潰瘍面積減小(黃芪多糖低劑量組潰瘍直徑1．0±0.23 mm)，使大鼠口腔潰瘍愈合只數增加，黃芪多糖中(潰瘍直徑0．50 ± 0．37 mm)、高劑量組(潰瘍直徑0．0 ±0．00 mm)的愈合率均為100%(表1)?？谇火つ兘M織的病理學觀察可見:模型對照組大鼠黏膜上皮溶解、破潰形成潰瘍，表面有纖維素性滲出物覆蓋，固有層內毛細血管擴張充血，血管周圍有大量淋巴細胞等炎性細胞浸潤(圖1B)。黃芪多糖低劑量組未完全愈合大鼠黏膜組織顯示上述病理表現緩解，上皮完整性基本恢復，淋巴細胞浸潤及滲出物明顯減少(圖1C)。

圖1 黃芪多糖治療后大鼠的口腔黏膜潰瘍病理學變化Fig.1 Pathological changes of rat oralmucosa after APS treatment

2．2 外周血T淋巴細胞亞群的變化

連續灌胃20 d后，各組大鼠外周血CD4+T細胞數、CD8+T細胞數的變化見表1。與正常對照組比，模型對照組大鼠外周血中CD4+T細胞數減少、CD8+T細胞數升高，CD4+/CD8+比值下降，有顯著性差異(P＜0．05);與模型對照組比，黃芪多糖藥物治療組的大鼠外周血中CD4+T細胞數升高、CD8+T細胞數降低，CD4+/CD8+比值明顯回升，有統計學差異(P＜0．05)，且隨著黃芪多糖劑量的增加，其數值越接近正常對照組。

2．3 血漿EGF的水平

從統計結果看，SD大鼠造模前實驗組血漿EGF含量為286．40 ±5．36，造模后血漿 EGF含量為259．4 ± 6．24(P＜ 0．05)，造模前后差異有統計學意義，見表2。造模后EGF含量的變化:第1周兩組血漿EGF無明顯變化，第4周實驗組血漿EGF含量出現明顯下降。黃芪多糖灌胃治療后血漿EGF含 量上升，尤其以中、高劑量組表現明顯。

表1 黃芪多糖治療后大鼠口腔潰瘍面直徑、愈合率及外周血T細胞亞群的變化Table 1 Diameters of oral ulcers，the healing rates and peripheral blood T cell subsets of rats after APS treatment

表2 SD大鼠造模前后血漿EGF及黃芪多糖治療后EGF含量比較(ng/L)Table 2 Plasma EGF levels in the SD ratmodel and EGF levels in the treatment of Astragalus polysaccharide(ng/L)

3 討論

復發性阿弗他潰瘍是一類常見的口腔黏膜炎性疾病，本病病因復雜，局部創傷、精神壓力、食物過敏、維生素及微量元素缺乏及遺傳傾向、免疫失調等系統性因素在某些患者的發病過程中具有一定作用［7］。

表皮生長因子(EGF)除可以影響與組織修復有關的細胞，如表皮細胞、成纖維細胞以及內皮細胞等的細胞周期轉換以加速細胞的分裂、增殖外，還可以促進組織修復細胞內DNA、RNA及蛋白質合成，這些均是 EGF參與組織修復的生物學基礎［8］。孫鵬［9］認為發生口腔潰瘍時各種來源的EGF均減少，使口腔黏膜細胞再生能力受抑，最終導致黏膜潰瘍形成。EGF可刺激口腔黏膜的生長和分化，尤其與基底細胞增殖的關系更為密切［10］。研究表明EGF濃度改變與口腔黏膜耐受創傷和創傷后愈合能力的強弱有密切關系［11］。EGF在正?？谇火つぶ械谋磉_主要分布在基底細胞層，本研究發現在正常口腔粘膜的基底細胞層細胞排列整齊，正?？谇火つさ幕准毎图毎梢援a生EGF，并以自分泌和旁分泌的方式作用于上皮細胞，維持口腔黏膜上皮細胞的分化和增殖。而發生口腔潰瘍時基底細胞層結構紊亂，EGF的自分泌和旁分泌受到抑制，EGF值明顯降低(P＜0．05)使口腔粘膜細胞再生增殖能力受到抑制，從而發生潰瘍。而在以黃芪多糖灌胃治療后，基底細胞層細胞排列又變得有序整齊，EGF值明顯升高，口腔粘膜上皮分泌EGF的功能恢復，潰瘍逐漸愈合。

上世紀60年代末，Lehner等首次提出細胞介導的免疫反應在復發性阿弗他潰瘍的發生發展過程中具有重要作用，這一觀點也被越來越多的學者所證實［12］。在正常情況下，CD4+T細胞和CD8+T細胞之間相互平衡，維持著正常的細胞免疫功能，而平衡被打破時，造成機體免疫功能的下降及紊亂，誘發非正常自身免疫反應，在口腔中表現為口腔黏膜上皮的溶解、破壞和組織壞死［9］，CD4+T細胞、CD8+T細胞亞群的比例會隨潰瘍的發生、發展、愈合而不斷變化［13］。本文的研究結果與 S．Sistig 等［14］的研究不同，但與程茜［5］等人的研究報道一致，S．Sistig等［14］采用流式細胞儀對RAU患者和正常人的外周血T細胞亞群進行檢測，發現RAU患者外周血T細胞亞群中CD4+T細胞比例明顯低于正常人群，而CD8+的T細胞比例正常。本實驗利用免疫方法建立阿弗他潰瘍動物模型，通過大鼠外周血T細胞亞群的測定發現:與正常對照組相比，RAU大鼠血液中CD4+T細胞數量下降、CD8+T細胞數量升高，CD4+/CD8+比值下降，差異具有統計學意義。表明細胞免疫功能紊亂是RAU發病過程中的一個重要環節。

黃芪多糖是黃芪的主要天然有效活性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應激、抗氧化及免疫調節等多種藥理作用［4］。一方面，黃芪多糖藥物促進口腔粘膜上皮基底細胞層EGF的分泌，維持口腔粘膜上皮的再生與增殖，使潰瘍面積減小，大鼠黏膜組織的炎癥表現有所緩解，淋巴細胞浸潤減少，上皮恢復完整性，高、中劑量組的愈合率100%。另一方面，黃芪多糖作為一種免疫調節劑，黃芪多糖能使大鼠淋巴細胞活性明顯升高，促進TNF-α、IL-β、IL-2等細胞因子發的分泌及IgA、IgG、IgM抗體的產生，從而發揮抗炎及顯著增強免疫作用［15］。本實驗用不同劑量APS連續灌胃治療20 d，APS可明顯改善RAU實驗性大鼠T細胞亞群的失衡狀態，外周血中CD4+T細胞的百分比明顯回升，CD8+T細胞數量降低及CD4+/CD8+比值升高，尤其在APS高劑量(300 mg/kg)的治療組中，CD4+T細胞、CD8+T細胞的百分比與正常對照組接近，提示APS能夠對RAU實驗性大鼠淋巴細胞亞群的失衡起調節作用，且顯示出劑量依賴性關系。因此，黃芪多糖具有明顯地促進口腔潰瘍愈合的作用，改善RAU實驗性大鼠T細胞亞群的失衡狀態，可作為一種潛在的用于治療和預防RAU的發生的中藥，但其調節RAU實驗性大鼠淋巴細胞亞群的機制仍需進一步研究。

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