油菜蜂花粉中皂苷化學成分的研究

戴志喬，徐德平

江南大學食品學院，無錫214122

油菜花粉(pollen)是十字花科植物油菜(Brassica campestris L)的有性生殖的雄性配子體。花粉濃縮了植株的營養精華，被人們譽為“最完美的食物”。蜂花粉是蜜蜂采集的花粉加入花蜜和唾液形成的粒狀物，因此，又被人們譽為“微型營養庫”［1］。具有抗腫瘤［2］、改善記憶力［3］、防治腦心血管疾病、調節神經系統、促進睡眠［4］、保肝護肝、防治前列腺疾病、調節腸胃功能等功能。

有關油菜蜂花粉化學成分的研究很多，主要集中在多糖、黃酮等，而對其中的皂苷尚未有研究報道。本文對油菜蜂花粉中的皂苷進行了初步研究，分離到三個齊墩果烷型皂苷，這在油菜蜂花粉中還是首次報道。

1 材料與儀器

油菜蜂花粉:購于南京老山藥業有限公司;乙醇、正丁醇、硫酸、茴香醛、冰乙酸、二甲亞砜均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供;GF254硅膠板:山東煙臺芝罘化工廠生產;AB-8型大孔吸附樹脂(100 mm ×1500 mm):天津南開大學化學工廠生產;ODS填料:Nacalai Tosoh Inc;MCI填料:Mitsubishi Chemical Corporation。

DFY-600搖擺式高速中藥粉碎機:溫嶺市林大機械有限公司;CQ-005型萃取罐:常州市特威電氣自動化系統有限公司;中壓輸液泵:天津科器高新技術公司;R-1002型旋轉蒸發儀:上海申順生物科技有限公司;核磁共振儀Avance 500 MHz:Buker公司。

2 提取與分離

2．1 油菜蜂花粉皂苷的提取

將油菜蜂花粉粉碎過60目篩，稱取15 kg，分次緩慢加入沸水浴中，煮沸30 min，充分滅酶后，濃縮至干。將滅酶后的花粉加入100 L萃取罐中，以料液比1∶5(w/v)加入體積分數為80%乙醇溶液，60℃提取2 h，過濾出清液，將濾渣再按上述方法重復提取二次，合并清液減壓濃縮至無乙醇時止。加入適量的水，用石油醚脫脂后，收集水相，減壓蒸干，待用。

2．2 油菜蜂花粉皂苷的粗分

將上述脫脂粗品上樣大孔樹脂［5］(100 mm ×1500 mm，樹脂為型號為AB-8)，調節層析柱流速約20 mL/min，分別用體積分數為30%、40%、50%、60%的乙醇梯度洗脫，TLC法跟蹤檢測洗脫液，將Rf值和顯色反應一致的洗脫液合并。利用L-B反應以及起泡性將40%、50%乙醇洗脫液合并濃縮得油菜蜂花粉總皂苷。

2．3 油菜蜂花粉皂苷的純化

將油菜蜂花粉總皂苷加水稀釋，上樣MCI柱(50 mm ×1500 mm)，調節流速15 mL/min，上樣結束后加入1500 mL去離子水洗脫，再用30%、40%、50%、60%的乙醇梯度洗脫，15 mL試管收集，經TLC鑒定和硫酸茴香醛顯色，將洗脫液分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個部分。將各部分濃縮至一定體積后再分別反復上ODS柱(30mm ×1000 mm)，分別用體積分數35% ～60%的乙醇-水梯度洗脫，洗脫流速5 mL/min，15 mL收集一管，經TLC鑒定純度，共得4個純化合物 1、2、3、4。

3 結構鑒定

以吡啶為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內標物，將上述四個化合物經氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)等光譜數據分析，結合文獻確定其化學結構。

化合物1 白色無定形粉末，可溶解于甲醇、乙醇、水，Liebermarm-Burchard反應呈陽性。從1H NMR 圖譜可見，δ5．4有1個 H 信號，δ5．02有1個雙峰質子信號，可能為糖的端基信號，推測該化合物含有 1 個糖基。δ1.25、1.20、1.16、1.14、0.95 有 5個單峰甲基，δ1.77，1.34，0.98 有 3 個雙峰甲基，其余H信號難以分辨。13C NMR(C5D5N，125 MHz)δ:38.6(C-1)，28.9(C-2)，90.0(C-3)，42.5(C-4)，55.9(C-5)，18.6(C-6)，33.5(C-7)，42.5(C-8)，47.9(C-9)，36.6(C-10)，22.9(C-11)，122.6(C-12)，145.1(C-13)，42.6(C-14)，28.2(C-15)，26.6(C-16)，33.6(C-17)，61.0(C-18)，40.1(C-19)，31.1(C-20)，42.6(C-21)，72.6(C-22)，28.9(C-23)，17.1(C-24)，15.8(C-25)，18.6(C-26)，25.9(C-27)，25.9(C-28)，33.4(C-29)，24.2(C-30)，101.8(Glc-1)，74.7(Glc-2)，76.9(Glc-3)，71.0(Glc-4)，75.8(Glc-5)，63.7(Glc-6)。

從13C NMR可見到36個碳信號，除6個糖信號外，苷元上有30個碳，分析化合物為皂苷，δ145.1、122.6處有2個雙鍵碳信號，從此信號可判斷該化合物母環為齊墩果烷型皂苷元。與標準齊墩果烷型皂苷的核磁共振碳譜和135DEPT圖譜比較發現，C-3的化學位移值從72移動到90.0，說明C-3成苷，δ72.6處有1個連氧CH信號，說明除C-3外還有被羥基取代的碳，分析所有碳信號并與標準齊墩果烷型皂苷的碳譜比較可判斷C-22有羥基取代，其化學位移置向低場移動31，C-21也向低場移動10，由此可得該化合物的苷元部分為3，22二羥基—齊墩果烷皂苷。糖的鏈接方式:從化學位移置來看為葡萄糖，與苷元的C-3相連。綜合以上分析并參照相關文獻可知該化合物為3，22二羥基，3-O-β-D-葡萄糖-齊墩果烷。結構式如圖1。

化合物2 白色無定形粉末，可溶解于甲醇、乙醇、水，Liebermarm-Burchard反應呈陽性。從1H NMR圖譜可見，δ5.6有1個雙峰H信號，可能雙鍵H信號，δ5.13有1個質子信號，應為糖的端基信號，該化合物連有 1 個糖基。δ1.31、1.28、1.20、1.19、0.93 有 5 個單峰甲基，δ1.78，1.32，0.96 有 3個雙峰甲基，其余 H信號難以歸屬。13C NMR(C5D5N，125MHz)δ:38.8(C-1)，29.6(C-2)，91.1(C-3)，42.5(C-4)，56.2(C-5)，18.7(C-6)，33.5(C-7)，42.5(C-8)，47.9(C-9)，36.5(C-10)，23.2(C-11)，122.6(C-12)，145.0(C-13)，42.6(C-14)，28.8(C-15)，26.6(C-16)，33.5(C-17)，61.9(C-18)，40.1(C-19)，31.1(C-20)，42.5(C-21)，72.6(C-22)，30.1(C-23)，19.1(C-24)，17.1(C-25)，18.7(C-26)，23.2(C-27)，26.0(C-28)，33.4(C-29)，24.2(C-30)，101.9(Glc-1)，78.6(Glc-2)，75.8(Glc-3)，71.4(Glc-4)，76.5(Glc-5)，69.5(Glc-6);102.3(Glc-1')，74.1(Glc-2')，76.8(Glc-3')，72.6(Glc-4')，76.3(Glc-5')，61.0(Glc-6');105.4(Glc-1″)，74.6(Glc-2″)，77.4(Glc-3″)，72.1(Glc-4″)，76.7(Glc-5″)，63.7(Glc-6″)。

從13C NMR可見到48個碳信號，除18個糖信號外，苷元上有30個碳，與化合物1相比較，苷元部分的化學位移值基本一致，說明化合物2與化合物1具有相同的苷元結構，二者不同僅在于糖鏈部分。化合物2有三個糖，從化學位移值來看三個糖都為葡萄糖。糖的鏈接方式:端基信號101.9的糖與苷元相連，另二個糖分別連在該糖的2、6位上。綜合以上分析可知該化合物為3，22二羥基，3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-［-β-D-吡喃葡萄糖 (1→6)］—齊墩果烷。結構式如圖1。

化合物3 白色無定形粉末，可溶解于甲醇、乙醇、水，Liebermarm-Burchard反應呈陽性。從1H NMR圖譜可見，δ5.4有1個雙峰H信號，δ5.08有1個質子信號，為糖的端基信號，推測該化合物含有1 個糖基。δ1.29、1.23、1.20、1.17、0.96 有 5 個單峰甲基，δ1.81、1.33、0.99有3個雙峰甲基，其余 H信號不能歸屬。

13C NMR(C5D5N，125 MHz)δ:38.8(C-1)，29.6(C-2)，91.1(C-3)，42.5(C-4)，56.2(C-5)，18.7(C-6)，33.5(C-7)，42.5(C-8)，47.9(C-9)，36.5(C-10)，23.2(C-11)，122.6(C-12)，145.0(C-13)，42.6(C-14)，28.8(C-15)，26.6(C-16)，47.7(C-17)，41.9(C-18)，40.1(C-19)，31.1(C-20)，42.5(C-21)，72.6(C-22)，30.1(C-23)，19.1(C-24)，17.1(C-25)，18.7(C-26)，23.2(C-27)，26.0(C-28)，33.4(C-29)，24.2(C-30)，101.9(Glc-1)，78.6(Glc-2)，75.8(Glc-3)，71.4(Glc-4)，76.5(Glc-5)，69.5(Glc-6);102.3(Glc-1')，74.1(Glc-2')，76.8(Glc-3')，72.6(Glc-4')，76.3(Glc-5')，61.0(Glc-6');105.4(Glc-1″)，74.6(Glc-2″)，77.4(Glc-3″)，72.1(Glc-4″)，76.7(Glc-5″)，63.7(Glc-6″)。

從13C NMR可見到48個碳信號，其中18個糖信號外，苷元上有30個碳，與化合物2相比較，糖鏈部分的化學位移置基本一致，說明化合物3與化合物Ⅱ具有相同的糖鏈結構，二者不同僅在于苷元部分。化合物3在δ175.3處有一個羧基，表明該化合物為齊墩果酸，對應有 C-17值為 47.7，C-18為41.9。綜合以上分析可知該化合物為3，22二羥基，3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-［-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)］—齊墩果酸。結構式如圖1。

化合物4 白色無定形粉末，可溶解于甲醇、乙醇、水。從1H NMR圖譜可見，δ5.4有1個雙峰H信號，δ5.02有1個質子信號，可能為糖的端基信號，推測該化合物含有1個糖基。δ1.03、0.94有2個單峰甲基，δ1.22、1.14、0.76有 3個雙峰甲基，0.97處有一個多峰甲基。

13C NMR(C5D5N，125 MHz)δ:37.6(C-1)，32.3(C-2)，78.7(C-3)，39.9(C-4)，141.1(C-5)，122.0(C-6)，34.4(C-7)，32.2(C-8)，50.5(C-9)，36.5(C-10)，21.4(C-11)，39.4(C-12)，42.6(C-13)，56.4(C-14)，24.6(C-15)，28.7(C-16)，57.0(C-17)，12.1(C-18)，19.2(C-19)，36.3(C-20)，19.2(C-21)，32.3(C-22)，29.4(C-23)，46.2(C-24)，12.3(C-25)，32.2(C-26)，12.1(C-27)，26.6(C-28)，21.6(C-29)，102.7(Glc-1)，75.4(Glc-2)，78.6(Glc-3)，71.9(Glc-4)，78.3(Glc-5)，63.0(Glc-6)。

從13C NMR可見到35個碳信號，其中6個糖信號外，苷元上有29個碳，根據化學位移值判斷該化合物為甾苷類化合物，對應C-3位連有一個葡萄糖。綜合分析并參照文獻可知該化合物為3-O-β-D-葡萄糖—谷甾醇苷。

圖1 化合物1、2、3的化學結構Fig．1 Chemical structures of compounds 1，2 and 3

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