HPLC法測定寧夏枸杞中法蓽枝苷的含量

徐 飛，王曉中，龔波林*

1寧夏回族自治區疾病預防控制中心，寧夏750004;2寧夏大學能源化工重點實驗室，寧夏750021

寧夏枸杞(Lycium barbarumL．)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)植物，在我國川北、華北北部、內蒙古、陜西、甘肅、寧夏、青海和新疆等地均有分布。寧夏枸杞(Lycii Fructus)又名枸杞子，是寧夏枸杞的干燥果實，其味甘、性平，歸肝、腎經，具有滋腎調肺，補肝明目的功效。現代藥理學研究證實，寧夏枸杞具有抗癌，抗衰老，抗腫瘤，降低血脂和血糖等多方面的藥理作用［1，2］。我們在對寧夏枸杞醇提物正丁醇部位活性成分的研究中，分離得到另外1個香豆素類化合物，經理化性質和波譜學數據分析鑒定了它的結構為法蓽枝苷(fabiatrin)，為寧夏枸杞中首次分離得到。現代藥理學研究表明，香豆素類化合物具有多種生物學活性，具有抗HIV、抗癌、抗炎、抗凝血、保護心血管系統等作用［3，4］。前文我們曾報道過，采用HPLC法測定了寧夏枸杞中東莨菪素(scopoletin)和東莨菪苷(scopolin)的含量［5］。本文我們建立了HPLC測定不同地區寧夏枸杞中法蓽枝苷含量的方法，為寧夏枸杞制定新的標準及品質評價提供依據。

1 材料與儀器

1．1 儀器和試藥

AM-400核磁共振譜儀(瑞士布魯克公司);LTQ-XL二維線性離子阱質譜儀(美國熱電公司);TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);Diamonsil C8柱(150 mm × 4．6 mm，5 μm)(迪馬公司);BS224S電子天平(德國賽多利斯公司);甲醇、乙腈為色譜純(天津市大茂化學試劑公司);醋酸為色譜純(天津市光復精細化工研究所);其他試劑均為國產分析純;水為純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

本實驗所用的原料購自寧夏藥材公司，依次編號為L1-寧夏枸杞Ⅰ號，L2-寧夏枸杞Ⅱ號，L3-寧夏農科院Ⅰ號，L4-寧夏農科院Ⅱ號，L5-寧夏南梁農場，L6-甘肅蘭州，L7-內蒙古沙海，L8-新疆精河。經寧夏醫科大學牛陽教授鑒定為寧夏枸杞(Lycium barbarumL．)的果實寧夏枸杞(Lycii Fructus)，憑證標本現存于寧夏天然產物工程中心。材料取回后，60℃真空干燥，粉碎后，粗粉過60～80目篩后，密封備用。

1．2 對照品的制備

法蓽枝苷的對照品為實驗室自制，系從寧夏枸杞70%醇提物正丁醇部位中分離得到，并經MS和NMR等現代譜學技術鑒定其結構;按照本方法的色譜條件歸一化法測得它們的純度為98．5%。理化性質及譜學數據如下:

化合物:淡黃色粉末(CH3OH)，mp．239 ～240℃。香草醛-濃硫酸反應顯紅色，254 nm和365 nm紫外燈下具強烈藍色熒光，提示可能為香豆素類化合物。ESI-MS，m/z:487．1［M+H］+;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7．82(1H，d，J=8．0 Hz，H-4)，7．23(1H，s，H-5)，7．12(1H，s，H-8)，6．24(1H，d，J=8．0 Hz，H-3)，4．94(1H，d，J=7．2 Hz)，4．24(1H，d，J=8．0 Hz)，3．10 ～ 5．0 為糖上其他氫原子信號;13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:169．3(C-2)，114．7(C-3)，145．7(C-4)，110．8(C-5)，148．3(C-6)，151．7(C-7)，103．2(C-8)，150．8(C-9)，114．6(C-10)，57．1(6-OCH3)，102．1(glc-1')，73．60(glc-2')，76．9(glc-3')，70．6(glc-4')，75．0(glc-5')，69．5(glc-6');105．5(xyl-1")，73．3(xyl-2")，77．3(xyl-3")，69．5(xyl-4")，66．0(xyl-5")。以上數據與文獻報道［6］的法蓽枝苷(fabiatrin)基本一致。結構見圖1。

圖1 法蓽枝苷的結構Fig.1 Chemical structure of fabiatrin

2 方法與結果

2．1 溶液制備

2．2．1 對照品溶液的制備

精密稱取法蓽枝苷2．0 mg置于100 mL容量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2．1．2 供試品溶液的制備

精密稱取干燥的寧夏枸杞粉末2．5 g，60℃甲醇回流提取3次，液料比=1∶20，回流時間依次為2 h、1．5 h、1 h。過濾后，用少量甲醇多次洗滌濾渣，合并濃縮提取液，轉入并定容于100 mL容量瓶中，用0．45μm的有機濾膜過濾，即得供試品溶液。

2．2 色譜條件

Diamonsil C8柱(150 mm × 4．6 mm，5 μm);流動相為 A:乙腈-水-醋酸(5∶94．5∶0．5)，B:乙腈-水-醋酸(72∶27．5∶0．5)，梯度范圍:0 ～18 min，100%-90%A，18 ～35 min，90% ～70%A，35-45 min，70%-0%A;柱溫:30℃;檢測波長:346 nm;流速:1 mL/min。法蓽枝苷對照品及供試品的HPLC圖見圖2。

圖2 法蓽枝苷(1)的對照品(A)及供試品(B)的色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of fabiatrin(1)reference substance(A)，and sample extract(B)

2．3 線性關系考察

精密移取法蓽枝苷的對照品溶液適量，以甲醇定容于10 mL容量瓶中，配制成濃度分別為0．1、0.2、0．5、1．0、2．0、2．5、5．0、10 μg/mL 的溶液。分別取上述溶液各20μL，平行進樣3次，取平均值。以質量濃度(X，μg/mL)為橫座標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線并進行回歸計算，得法蓽枝苷回歸方程為Y=18961X+417．58(r=0．9998，n=8)。表明法蓽枝苷在0．1～10μg/mL范圍內線性良好。

2．4 檢測限試驗

逐級稀釋(2．1．1)項下的樣品溶液，按照(2．2)項中所述色譜條件進樣，當信噪比為3∶1時法蓽枝苷的檢測限為0．15μg/mL。

2．5 精密度試驗

分別配制低、中、高3個質量濃度的法蓽枝苷對照品溶液，按照(2．2)項中所述色譜條件進樣，1 d內重復測定5次，考察日內精密度;連續測定5 d，考察日間精密度。試驗結果見表1。

表1 精密度試驗結果(n=5)Table 1 Intra-day and inter-day precision test of fabiatrin(n=5)

2．6 重復性試驗

取干燥的寧夏枸杞粉末6份，按(2．1．2)項所述的方法操作，制得6份溶液，每次進樣20μL，測定峰面積，計算樣品中法蓽枝苷含量的平均值(n=6)為44．2 μg/g;RSD 為1．97%。

2．7 穩定性試驗

供試品溶液在0～12 h內每隔2 h進樣20 μL，測定峰面積，計算樣品中法蓽枝苷峰面積的RSD為1．76%。結果表明在12 h內供試品溶液穩定。

2．8 加樣回收率試驗

取已知含量(其中法蓽枝苷43．3μg/g)的干燥的寧夏枸杞粉末6份，每份1．0 g，分別向其中加入適量的法蓽枝苷對照品，按(2．1．2)項所述的方法操作，制得6份供試品溶液，每次進樣20μL，測定峰面積，計算樣品中法蓽枝苷的平均回收率。試驗結果見表2。

表2 法蓽枝苷的加樣回收率試驗結果Table 2 The results of recovery test of fabiatrin

2．9 樣品測定結果

分別精密吸取法蓽枝苷對照品溶液和供試品溶液各20μL，平行進樣3次，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算樣品中法蓽枝苷的含量。試驗結果見表3。

表3 不同地區寧夏枸杞中法蓽枝苷的含量(n=3)Table 3 Concentrations of fabiatrin detected in Lycii Fructus from different regions(n=3)

L3 2012-08-14 38．7 1．77 L4 2012-08-14 39．8 1．43 L5 2012-08-15 37．5 1．86 L6 2011-08-10 34．2 1．65 L7 2012-08-07 26．1 2．01 L8 2012-08-16 30．5 2．10

3 討論

3．1 提取條件的優化

本文考察了不同溶劑對提取的影響，比較了乙醇、甲醇和80%甲醇。結果以甲醇提取效率最佳，乙醇的提取率最低。通過不同固液比的提取率的比較，發現m(寧夏枸杞)∶V(甲醇)=1∶20的溶劑量較為合適。3次回流時間分別選擇2、1．5、1 h的依據是首次提取需要浸潤的時間長，而后含量相對減少，所以后2次提取時間依次遞減。

3．2 流動相的選擇

分別考察了不同比例甲醇-水和乙腈-水的流動相，發現流動相為乙腈-水能獲得較好的分離效果，但是存在拖尾現象，在考察加入不同緩沖鹽及酸后發現在流動相中加入0．5%的醋酸以后效果最好，峰形得到明顯改善。

3．3 最大吸收波長的選擇

根據紫外光譜圖顯示法蓽枝苷的最大吸收波長在346 nm，故選定346 nm為測定波長。

3．4 小結

結合文獻［5］，我們在對寧夏枸杞化學成分的研究過程中發現，寧夏枸杞中的香豆素類化合物主要是東莨菪素及其苷類，即1號色譜峰為法蓽枝苷(fabiatrin)、2號色譜峰為東莨菪苷(scopolin)和3號色譜峰為東莨菪素(scopoletin)。通過HPLC法測定其含量表明，不同地區寧夏枸杞中這3個香豆素的含量存在差異，其中法蓽枝苷的含量從26．1～43．3 μg/mL間不等。

本方法可以準確、快捷的測定寧夏枸杞中法蓽枝苷的含量。本文所建立的方法，重復性及回收率好，結果可靠。

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