以CAM為活性導向快速分離抑制血管新生活性成分

莊文婷，朱路平，向 誠，何 靜，李 鵬，2，李寶才*

1昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明650500;2澳門大學中華醫(yī)藥研究院中藥質量研究國家重點實驗室，澳門000856

活性篩選在天然產(chǎn)物活性成分的研究中被廣泛運用，通過活性篩選的方法可以快速獲得具有生物活性的先導化合物，所以選擇一個可靠性強、操作簡單、也能適應大規(guī)模篩選的模型尤為重要［1］。目前，被廣泛運用于活性篩選的多為各種體外藥理模型，相較于體外藥理模型，體內(nèi)藥理模型更能模擬體內(nèi)生理環(huán)境，具有更高的可靠性。CAM在研究血管新生方面是一個被公認的可靠性高，操作簡單的體內(nèi)模型［2］。病理性的血管新生會引發(fā)風濕性關節(jié)炎、糖尿病性失明、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病，其與癌癥的發(fā)生也有著密切的聯(lián)系，抑制血管新生劑近年來被視為腫瘤治療的新途徑［3］，因此，尋找具有血管新生抑制作用的活性成分迅速成為藥物研究的一大熱點。二萜類化合物在云南鼠尾草和丹參中廣泛存在，其中，丹參酮ⅡA、隱丹參酮為其特征性成分［4］，并已經(jīng)報道具有抑制血管新生活性，所以快速有效的分離得到這類成分對于研究開發(fā)二萜類抑制血管新生劑有重要的意義。筆者采用CAM活性追蹤的分離方法對云南鼠尾草和丹參進行分離，相對快速的獲得較大量的丹參酮ⅡA、隱丹參酮，同時首次發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅰ、丹參內(nèi)酯、柳杉醇具有抑制血管新生活性。

1 儀器與材料

1．1 儀器

V-400(瑞士 Brucker)和 DRX-500(英國牛津DRX)超導核磁共振儀;VG AUTO Spec-3000(英國Micromass)和APIQstar Plusar(美國應用生物系統(tǒng)公司)質譜儀;Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent);注射器(1 mL)、砂輪、止血鉗、鑷子、載玻片、移液槍、透明膠、恒溫培養(yǎng)箱、超潔凈工作臺、數(shù)碼照相機等。

1．2 材料

Sephadex LH-20(20～100 μm，Pharmacia Fine Chemical Co．，Ltd．)，MCI gel CHP20P(75 ～ 150 μm，Mitsubishi Chemical Co．，Ltd．)，Rp-18(40 ～ 50 μm，Merk Co．，Ltd．)，柱層析硅膠(200 ～300 目)及薄層層析硅膠(GF254)均為青島海洋化工廠產(chǎn)品;顯色劑:5%硫酸-乙醇溶液;柱層析溶劑均為工業(yè)級重蒸溶劑、新潔爾滅消毒液、75%乙醇消毒液、生理鹽水、地塞米松注射液(購自云南白藥)、PBS緩沖液、甲醇(AR)、丙酮(AR)、種蛋(昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司)。

正品丹參(Salvia miltiorrhizaBunge)購自云南福林堂中藥房，產(chǎn)自河北;云南鼠尾草藥材于2010年8月采自云南省麗江市，由云南省中醫(yī)中藥研究院郭世民研究員鑒定為唇形科植物云南鼠尾草(Salvia yunnanensisC．H．W right)。樣本現(xiàn)存于昆明理工大學生命科學與技術學院天然產(chǎn)物制藥實驗室。

2 活性部位的篩選

2．1 極性段的劃分

干燥云南鼠尾草(6 kg)全草，粉碎過60目篩，用100%丙酮(每次20 L)室溫下超聲提取三次，每次2 h，提取液減壓濃縮得粗浸膏200 g。所得浸膏經(jīng)硅膠柱色譜石油醚-乙酸乙酯梯度(1∶0、9∶1、3∶1、1∶1、3∶7)洗脫，TLC 檢測合并得 5 個部分，F(xiàn)r．1(50 g)、Fr．2(32 g)、Fr．3(14 g)、Fr．4(26 g)、Fr．5(60 g)。

干燥正品丹參(2 kg)，粉碎過60目篩，用100%丙酮(每次20 L)室溫下超聲提取三次，每次2 h，提取液減壓濃縮得粗浸膏78 g。同上述方法將所得粗浸膏進行極性段劃分，得到5個部分，分別為:Fr．1'(16 g)、Fr．2'(10 g)、Fr．3'(8 g)、Fr．4'(15 g)、Fr．5'(20 g)。

2．2 極性段的活性篩選

采用雞胚尿囊膜模型(CAM)對各極性段進行活性篩選，實驗設置空白組和陽性對照藥組(地塞米松)，以及 Fr．1、Fr．2、Fr．3、Fr．4、Fr．5(Fr．1'、Fr．2'、Fr．3'、Fr．4'、Fr．5')五個給藥組，每組6 只造模成功的雞胚，將各極性段物質用無水乙醇配制成400 μg/mL的溶液待用。購買的活雞胚在孵育箱中以37°C、CO25%、濕度適宜的條件孵育7 d后，在氣室端開窗(1×1 cm)，用直徑為6 mm的無菌濾紙片作為給藥載體，給藥組在濾紙片上加入20μL配制好的溶液，在超凈臺中將無水乙醇揮干，放置于尿囊膜上，每只雞胚加入20μL生理鹽水便于給藥片與尿囊膜貼合，空白組在濾紙片上加20μL無水乙醇，在超凈臺中將無水乙醇揮干，放置于尿囊膜上，每只雞胚加入20μL生理鹽水便于給藥片與尿囊膜貼合，用無菌透明膠帶封窗后放入孵育箱中繼續(xù)孵育48 h后，滴入固定液(甲醇-丙酮1∶1)將尿囊膜上的血管做固定處理，然后取下尿囊膜組織，數(shù)碼相機微距拍照，圖片用IPP圖像處理軟件對血管面積進行計算［5］。結果見圖 1 A(云南鼠尾草)、B(丹參)，從圖中可以看出云南鼠尾草中 Fr．2、Fr．3、Fr．4 有較好的活性;丹參中Fr．2'和Fr．4'有較好的活性。

圖1 云南鼠尾草(A)及丹參(B)各極性段CAM血管生長面積點數(shù)Fig.1 The vascular area dots of CAM with different fractions from S．yunnanensis(A)and S．miltiorrhiza(B)．

3 活性極性段的分離

3．1 云南鼠尾草活性極性段分離

從 CAM 活性篩選結果中選定 Fr．2、Fr．3、Fr．4三個極性段進行進一步的分離。Fr．2(32 g)的分離:經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-氯仿(50∶50 ～0∶100)梯度洗脫，TLC檢測合并相同組分，所得Fr．1(1)反復上硅膠柱得化合物1(240 mg)，F(xiàn)r．1(2)反復上硅膠柱得到化合物2(46 mg)，化合物3(33 mg)。Fr．3(14 g)的分離:以石油醚-乙酸乙酯(15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、2∶1)梯度洗脫，洗脫樣品餾分分瓶收集，常溫析出結晶，吸出母液，以少量石油醚洗滌結晶得到紅色塊狀結晶，得到化合物4(13 g)，其他組分經(jīng)硅膠柱色譜及Sephadex LH 20凝膠純化得到化合物5(10 mg)。Fr．4(26 g)的分離:經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-乙酸乙酯-甲醇(90∶10∶10 ～50∶50∶10)三項系統(tǒng)梯度洗脫，TLC檢測合并相同組分，所得組分反復上硅膠柱，利用HPLC半制備液相制備得到化合物6(18 mg)，F(xiàn)r．4(2)反復上 Sephadex LH 20凝膠柱得到化合物7(7 mg)，F(xiàn)r．4(3)反復上硅膠柱，所得溶液放置析出白色塊狀晶體，石油醚反復洗滌得到化合物8(15 mg)。

3．2 丹參活性極性段分離

從 CAM 活性篩選結果中選定 Fr．2'、Fr．4'兩個極性段極性分離，F(xiàn)r．2'(10 g)的分離:以石油醚-乙酸乙酯(15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、2∶1)梯度洗脫，洗脫樣品餾分分瓶收集，常溫析出結晶，反復洗滌得到化合物1'(160 mg)，母液利用TLC檢測合并為三個部分，第一部分經(jīng)過反復硅膠柱層析純化得到化合物2'(20 mg)。Fr．4'(15 g)的分離:經(jīng) MCI柱層析MeOH-H2O(50%、70%、80%、90%)梯度洗脫，50%MeOH-H2O洗脫部分反復硅膠柱色譜得化合物3'(10 mg)，70%MeOH-H2O洗脫部分反復硅膠柱色譜和Sephadex LH-20純化得化合物4'(16 mg)、化合物5'(50 mg)。

通過TLC及HPLC檢測分析發(fā)現(xiàn)，云南鼠尾草中分離得到的化合物1、3、6、7分別與丹參中分離得到的化合物 1'、2'、3'、4'的Rf值和保留時間相同，因此將這8個化合物合并標記為化合物1、3、6、7。

4 結構鑒定

化合物1 紅色粉末，ESI-MSm/z:295［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:1.82(2H，m，H-1)，1.67(2H，m，H-2)，3.19(2H，m，H-3)，7.60(1H，d，J=6.4 Hz，H-6)，7.56(1H，d，J=6.4 Hz，H-7)，7.25(1H，s，H-16)，2.24(3H，s，Me-17)，1.26(6H，s，Me-18，Me-19);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:29.9(C-1)，19.4(C-2)，37.7(C-3)，34.9(C-4)，150.4(C-5)，133.6(C-6)，120.5(C-7)，127.7(C-8)，126.0(C-9)，144.5(C-10)，183.3(C-11)，174.9(C-12)，121.4(C-13)，161.9(C-14)，120.5(C-15)，142.0(C-16)，9.2(C-17)，33.1(C-18，C-19)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［7］報道基本一致，故鑒定化合物1為丹參酮ⅡA。

化合物2 無色針狀結晶，EI-MSm/z:264(［M］+，100)，263(33)，208(25)，184(24)，165(20);1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:8.34(1H，d，J=8.2，H-1)，7.39(1H，dd，J=8.2，8.2，H-2)，7.35(1H，d，J=8.2，H-3)，7.75(1H，d，J=8.8，H-6)，7.69(1H，d，J=8.8，H-7)，7.35(1H，s，H-16)，2.34(3H，s，Me-17)，2.63(3H，s，Me-18);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:120.3(C-1)，126.5(C-2)，127.9(C-3)，135.5(C-4)，124.5(C-5)，120.7(C-6)，116.6(C-7)，109.2(C-8)，108.0(C-9)，132.9(C-10)，157.9(C-11)，159.0(C-13)，149.0(C-14)，141.0(C-15)，120.3(C-16)，8.4(C-17)，19.5(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［7］報道基本一致，故鑒定化合物2為丹參內(nèi)酯。

化合物3 紫紅色粉末，ESI-MSm/z:277［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.24(1H，d，J=8.8 Hz，H-1)，7.53(1H，dd，J=8.8 Hz，H-2)，7.29(1H，d，J=8.8 Hz，H-3)，8.28(1H，d，J=8.8 Hz，H-6)，7.79(1H，d，J=8.8 Hz，H-7)，7.30(1H，s，H-16)，2.30(3H，s，Me-17)，2.70(3H，s，Me-18);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:124.9(C-1)，130.7(C-2)，128.6(C-3)，134.9(C-4)，133.7(C-5)，133.0(C-6)，119.0(C-7)，129.5(C-8)，123.0(C-9)，133.0(C-10)，183.6(C-11)，176.1(C-12)，122.0(C-13)，161.2(C-14)，120.8(C-15)，142.3(C-16)，8.5(C-17)，20.0(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［7］報道基本一致，故鑒定化合物3為丹參酮Ⅰ。

化合物4 紅色粉末，ESI-MSm/z297［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:3.18(2H，m，H-1)，1.73(2H，m，H-2)，1.62(2H，m，H-3)，7.61(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，7.46(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，3.54(1H，m，H-15)，4.86(1H，t，J=9.2 Hz，H-16a)，4.32(1H，dd，J=6.0，9.2 Hz，H-16b)，1.18(3H，s，Me-17)，1.30(3H，s，Me-18)，1.33(3H，s，Me-19);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:29.7(C-1)，19.3(C-2)，37.9(C-3)，34.8(C-4)，152.4(C-5)，132.8(C-6)，122.5(C-7)，128.5(C-8)，126.9(C-9)，143.7(C-10)，184.5(C-11)，175.7(C-12)，118.4(C-13)，170.8(C-14)，34.5(C-15)，81.4(C-16)，18.8(C-17)，31.9(C-18)，31.8(C-19)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［6］報道基本一致，故鑒定化合物4為隱丹參酮。

化合物 5 白色固體，1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:0.75，0.83，0.85，0.88，0.89，0.93，0.98，1.12(each 3H，Me-23，24，25，26，27，28，29 and 30)，3.20(1H，m，H-3)，5.15(1H，m，H-12);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:38.7(C-1)，27.0(C-2)，79.0(C-3)，38.97(C-4)，55.1(C-5)，18.5(C-6)，32.7(C-7)，39.7(C-8)，47.8(C-9)，37.3(C-10)，23.4(C-11)，121.7(C-12)，145.0(C-13)，41.7(C-14)，28.3(C-15)，26.2(C-16)，32.5(C-17)，47.5(C-18)，46.8(C-19)，31.1(C-20)，34.8(C-21)，37.2(C-22)，28.1(C-23)，15.7(C-24)，15.5(C-25)，16.9(C-26)，26.5(C-27)，27.7(C-28)，33.2(C-29)，23.6(C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［7］報道基本一致，故鑒定化合物 5為 β-Amyrin。

化合物6 紅色粉末，ESI-MSm/z:279［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.28(1H，d，J=8.8 Hz，H-1)，7.57(1H，t，J=8.8 Hz，H-2)，7.40(1H，d，J=8.8 Hz，H-3)，8.28(1H，d，J=8.8 Hz，H-6)，7.75(1H，d，J=8.8 Hz，H-7)，3.63(1H，m，H-15)，4.96(1H，t，J=9.6 Hz，H-16α)，4.44(1H，dd，J=6.4，9.6 Hz，H-16β)，1.39(3H，d，J=7.0 Hz，Me-17)，2.70(3H，s，Me-18);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:124.9(C-1)，130.4(C-2)，128.8(C-3)，134.9(C-4)，134.7(C-5)，131.9(C-6)，120.2(C-7)，128.1(C-8)，125.9(C-9)，132.0(C-10)，184.2(C-11)，175.6(C-12)，118.3(C-13)，170.6(C-14)，34.6(C-15)，81.6(C-16)，18.8(C-17)，19.8(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［8］報道基本一致，故鑒定化合物6為二氫丹參酮Ⅰ。

化合物7 白色顆粒狀晶體，ESI-MS:m/z 301［M+H］+，323 ［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:0.86(3H，s，Me-18)，0.92(3H，s，Me-19)，1.12(3H，s，Me-20)，1.13(6H，d，J=6.4 Hz，Me-16，Me-17)，1.18 ～ 2.48(6H，m，H-1，H-2，H-3)，1.71(1H，m，H-5)，2.48(2H，m，H-6)，3.13(1H，sept，J=6.4 Hz，H-15)，6.78(1H，s，H-11)，7.64(1H，s，H-14)，10.27(1H，s，OH-12);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:37.5(C-1)，18.5(C-2)，40.9(C-3)，32.9(C-4)，49.1(C-5)，35.6(C-6)，196.6(C-7)，122.6(C-8)，155.9(C-9)，39.1(C-10)，109.4(C-11)，160.2(C-12)，132.6(C-13)，125.1(C-14)，26.1(C-15)，22.3(C-16)，22.4(C-17)，32.3(C-18)，21.2(q，C-19)，23.1(C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［9］報道基本一致，故鑒定化合物7為柳杉醇。

化合物 8 白色固體，1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:0.85，0.97，0.98，0.99，1.04，1.07(each 3H，s Me-23，24，25，26，27，29，30)，3.47(1H，dd，J=5.95，4.0，H-3)，5.35(1H，t，J=3.5，H-12);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:39.7(C-1)，37.9(C-2)，78.7(C-3)，39.5(C-4)，55.7(d，C-5)，19.0(C-6)，31.6(C-7)，39.5(C-8)，49.4(C-9)，39.8(C-10)，23.7(C-11)，126.0(C-12)，139.7(C-13)，40.5(C-14)，28.7(C-15)，25.5(C-16)，48.5(C-17)，53.9(C-18)，39.5(C-19)，39.8(C-20)，31.8(C-21)，37.6(C-22)，28.9(C-23)，24.5(C-24)，15.7(C-25)，17.1(C-26)，23.3(C-27)，179.9(C-28)，16.6(C-29)，21.5(C-30);以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［10］報道基本一致，故鑒定化合物8為urosolic acid。

化合物5' 黃色粉末;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:5.47(1H，d，J=10.2，H-2)，3.20(1H，m，H-3α)，2.69(1H，m，H-3β)，5.95(2H，brs，H-6，H-8)，7.38(2H，d，J=8.8，H-2'，H-6')，6.69(2H，d，J=8.8，H-3'，H-5');13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:79.6(C-2)，43.6(C-3)，197.4(C-4)，165.5(C-5)，96.6(C-6)，167.4(C-7)，95.5(C-8)，164.3(C-9)，103.3(C-10)，130.7(C-1')，129.0(C-2'and 6'0，116.4(C-3'，C-5')，158.9(C-4')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［7］報道基本一致故鑒定化合物 5'為 5，7，4'-Trihydroxy flavanone。

5 化合物活性篩選

從云南鼠尾草和丹參中分離得到的9個化合物，采用CAM模型對其進行抑制血管新生活性的篩選，實驗設置空白組和陽性對照藥組(地塞米松組)，以及化合物 1、2、3、4、5、6、7、8、5'9 個給藥組，每組6只雞胚，將各化合物用無水乙醇配制成0.08 nmol/L的溶液待用。其余步驟與2.2所述方法相同。實驗結果如表1，圖2、3所示，實驗結果顯示:化合物1、2、3、4、7有較好的抑制血管新生活性。

6 數(shù)據(jù)處理

CAM血管面積計數(shù)通過IPP軟件計算得到，根據(jù)血管顏色與尿囊膜組織顏色的區(qū)別，利用IPP軟件濾鏡處理技術，增強顏色對比，通過采集圖像上的不同色彩點數(shù)來計算得到血管面積;得到的血管面積數(shù)據(jù)用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件處理，得到T檢驗數(shù)據(jù)。

表1 各化合物對血管生長的抑制作用(n=6±s)Table 1 Inhibition of vascular growth on CAM by the isolated compounds(n=6±s)

表1 各化合物對血管生長的抑制作用(n=6±s)Table 1 Inhibition of vascular growth on CAM by the isolated compounds(n=6±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05;＊＊ P ＜ 0.01;＊＊＊ P ＜0.001.

組別Group濃度Concentration(nmol/L)血管面積數(shù)Vascular area date(dots)抑制率Inhibition ratio(%)69.6化合物2 Compound 2 0.8 257±95＊＊ 25.1化合物3 Compound 3 0.8 189±44＊＊ 44.9化合物4 Compound 4 0.8 107±46＊＊＊ 68.8化合物5 Compound 5 0.8 421±87 -22.7化合物6 Compound 6 0.8 423±70 -23.3化合物7 Compound 7 0.8 110±61＊＊＊ 67.9化合物8 Compound 8 0.8 373±86 -0.1化合物5'Compound 5' 0.8 400±100 -16.7地塞米松 Dexamethasone 92±20＊＊＊ 73.1生理鹽水化合物1 Compound 1 0.8 104±50＊＊＊Normal saline 343±72

7 討論

目前，基于活性追蹤為指導的化合物分離方法大都選用細胞株、菌種以及各種色譜設備作為篩選模型，由于與體內(nèi)環(huán)境相差較大，常導致體內(nèi)重現(xiàn)性較差的問題出現(xiàn)。尋找到合適的體內(nèi)的模型可以優(yōu)化活性篩選的方法，達到快速有效的篩選目的。雞胚尿囊膜模型(CAM)是目前被公認的可靠性高，操作簡單，成本低廉的抑制血管新生的體內(nèi)藥理模型，相較于目前較為成熟的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的血管新生體外藥理模型，其在成本和操作性上都有明顯優(yōu)勢，研究過程中運用CAM首先明確活性部位，有效加快了活性化合物的分離速度，顯著提高了分離的目的性和可靠性。通過進一步的活性追蹤和化學分離鑒定，成功獲得一定量的丹參酮ⅡA、隱丹參酮，并且首次證實了丹參酮Ⅰ、丹參內(nèi)酯、柳杉醇具有抑制血管新生的活性。為今后研究中快速獲得二萜類抑制血管新生活性的化合物提供了一條新的有效的途徑，同時，這種快速分離的方法也為研究具有促進血管新生等生物活性的天然產(chǎn)物活性成分的分離提供一種新的分離模式。

此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)，具有活性的化合物均為松香烷型二萜類物質，其中，在CAM中顯示出較好抑制血管新生活性的丹參酮ⅡA、隱丹參酮，在結構方面有明顯的共同點，在A環(huán)4位上均有兩個甲基取代，都有醌類結構，13，14位均接有含氧呋喃環(huán)，這些結構特征有助于在今后的研究中從結構方面研究此類物質對血管新生的影響;但是，在分離過程中得到的二氫丹參酮Ⅰ也是一種松香烷型二萜物質，但其在CAM模型上并未表現(xiàn)出抑制血管新生的活性，因此，對于松香烷型二萜類物質與血管新生的影響還需要做進一步的構效關系研究。

致謝:化合物波譜數(shù)據(jù)由中國科學院昆明植物研究所分析測試中心測定。

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